论文部分内容阅读
目的应用芯片技术和分子生物学技术研究在丙戊酸钠(Valproate,VPA)诱导海马神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)向神经元分化过程中miR-29a-5p所起的作用。实验一:大鼠海马神经干细胞VPA处理后mRNAs和miRNAs差异表达谱的构建方法(1)分离培养大鼠胚胎海马NSCs,设置VPA浓度梯度0.3mM、0.6mM、1mM和3mM,用VPA和对照溶剂分别进行处理,免疫荧光检测细胞凋亡情况。(2)运用免疫荧光、蛋白质免疫印迹(Western blot)和细胞流式技术检测VPA在海马NSCs中的组蛋白乙酰化水平及在NSCs增殖和分化中的作用。(3)利用实时定量PCR检测关键的神经元特异分子—突触蛋白1(Synapsin I,Syn1)和微管相关蛋白2(Microtubule-associated protein 2,Map2),在VPA处理后的动态表达,选择神经元特异分子表达开始显著增加的时间点收取芯片样本。(4)样本送生物芯片公司,构建mRNAs和miRNAs差异表达谱,得到差异倍数在1.5倍以上、P值小于0.05的mRNAs和miRNAs数据。(5)收取VPA处理组和对照组的细胞样本,提取总RNA,利用实时定量PCR对部分差异mRNAs和miRNAs进行验证。结果(1)VPA浓度≤1mM处理海马NSCs时没有出现明显的凋亡。(2)免疫荧光、Western blot和细胞流式结果显示,VPA可上调组蛋白的乙酰化水平,抑制NSCs增殖,促进NSCs分化为神经元并抑制其向星形胶质细胞分化。(3)实时定量PCR结果显示,在VPA处理24h后神经元特异分子Syn1和Map2的表达开始明显增加。(4)基因芯片结果显示2410个mRNAs和7个miRNAs呈现明显的差异性表达。mRNAs中上调的有1660个,下调的有750个;差异miRNAs中上调的有6个,下调的有1个。(5)实时定量PCR结果表明,差异mRNAs中验证的12个mRNAs与基因芯片基本一致;7个差异miRNAs中有5个验证结果与基因芯片一致。实验二:miR-29-5p在大鼠海马NSCs增殖与分化过程中的功能研究方法(1)提取SD大鼠端脑、小脑、脑干、海马、心脏、肝脏和骨骼肌总RNA,实时定量PCR检测miR-29a-5p的组织特异性。(2)体外分离培养NSCs、神经元和星形胶质细胞,提取总RNA,实时定量PCR检测miR-29a-5p的细胞特异性。(3)用miR-29a-5p类似物(mimic)转染NSCs,设置浓度梯度10nM、20nM、50nM、100nM和200nM,荧光显微镜下观察转染效率,并利用实时定量PCR检测miR-29a-5p的过表达效率。(4)用miR-29a-5p mimic转染NSCs,实时定量PCR检测关键神经元特异分子—Map2、Syn1、神经元分化因子1(Neuronal differentiation 1,Neurod1)、微管解聚蛋白2(Stathmin2,Stmn2)的表达。(5)细胞免疫荧光、Western blot和细胞流式技术检测miR-29a-5p过表达对NSCs增殖的影响。(6)细胞免疫荧光和Western blot技术检测miR-29a-5p过表达对NSCs向神经元分化的影响。结果(1)miR-29a-5p的表达呈现组织特异性和细胞特异性,在大脑皮质和海马组织及NSCs中呈现特异性高表达。(2)miR-29a-5p mimic转染浓度20nM、50 nM、100 nM,荧光强度均较强,过表达效率均较高。(3)实时定量PCR结果显示,20nM mimic处理24h时神经元特异分子—Map2、Syn1、Neurod1、Stmn2的mRNA表达均显著上调。(4)细胞免疫荧光和Western blot结果显示,miR-29a-5p mimic过表达可抑制NSCs的增殖,促进NSCs向神经元分化。结论1.VPA可上调组蛋白乙酰化水平,抑制NSCs增殖,促进NSCs分化为神经元并抑制其向星形胶质细胞分化。2.VPA诱导海马NSCs分化过程中,差异表达的12个mRNAs验证结果与基因芯片基本一致;7个miRNAs有5个验证结果与基因芯片一致。3.miR-29a-5p过表达可抑制海马NSCs的增殖,促进海马NSCs向神经元分化。