【摘 要】
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实验目的： 骨肉瘤作为最常见的骨组织恶性肿瘤之一;具有较高的发病率和病死率。目前多种化疗药物已经用于骨肉瘤的治疗;然而仍无法取得满意的疗效。熊果酸（Ursolic acid; UA
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实验目的： 骨肉瘤作为最常见的骨组织恶性肿瘤之一;具有较高的发病率和病死率。目前多种化疗药物已经用于骨肉瘤的治疗;然而仍无法取得满意的疗效。熊果酸（Ursolic acid; UA）是一种具有多种抗肿瘤活性的天然化合物;其对骨肉瘤的作用尚不明确。本课题主要研究 UA 对人骨肉瘤细胞生长的抑制作用及可能的分子机制。 研究方法： 使用不同浓度的UA分别干预多种人骨肉瘤细胞株（MG63;143B; U2OS 和 Saos2）;于24h、48h和72h进行结晶紫染色筛选出对UA最敏感细胞株和 UA 的有效浓度范围。进而采用多种检测技术评价 UA对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡和转移侵袭的影响;以及探讨可能的分子机制。主要实验步骤如下： 1. CCK-8检测UA对人骨肉瘤143B细胞活力的影响;流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡情况;划痕实验、Transwell 迁移和侵袭实验检测UA对细胞迁移和侵袭的影响;Western blot检测增殖、凋亡、迁移相关指标; 2.采用裸鼠体内异位成瘤模型、H&E、免疫组化染色、Western blot等技术检测UA对人骨肉瘤增殖、凋亡、迁移的影响; 3.利用荧光素酶报告基因检测 UA 对 Tcf/Lef 荧光素酶报告质粒pTOP-luc的转录活性影响。利用Western blot;免疫组化检测 β-catenin在胞内的分布情况;以及cyclin D1、c-myc等相关分子的表达; 4.利用结晶紫、CCK-8、流式细胞术、transwell实验等;检测过表达及沉默表达β-catenin时;UA对人骨肉瘤细胞143B增殖、凋亡及迁移的影响; 5.利用RT-PCR及Western blot技术检测UA对143B细胞中p38 MAPK和p53 mRNA及蛋白表达的影响。利用结晶紫、CCK-8;检测p38 MAPK抑制剂及p53 抑制剂对UA抑制143B细胞增殖的影响。Western blot检测p38 MAPK抑制剂对p53表达的影响;和p53抑制剂对β-catenin及其相关蛋白表达的影响。 研究结果： 1. UA能诱导143B细胞G1期阻滞及调节细胞周期相关蛋白的表达;抑制人骨肉瘤细胞的增殖;能调节凋亡相关因子的表达诱导人骨肉瘤细胞凋亡;能抑制MMP2、MMP9 等因子减少人骨肉瘤细胞的迁移及侵袭; 2. UA能显著抑制异位肿瘤模型中人骨肉瘤的生长;诱导肿瘤细胞发生凋亡;抑制迁移因子的表达; 3. UA 减弱 143B 细胞中 Tcf/Lef 报告质粒的转录活性;抑制β-catenin的表达及入核;并且下调Wnt/β-catenin相关靶基因的表达; 4.过表达β-catenin能减弱UA对人骨肉瘤细胞生长的抑制作用;而干扰β-catenin则相应增强UA抗人骨肉瘤细胞的活性; 5. UA提高p53的表达;促进p38 MAPK磷酸化。抑制p38 MAPK可部分逆转UA对p53的促进作用;并且抑制p53的活性可以部分阻断UA对Wnt/β-catenin信号的抑制作用。 研究结论： UA作为一种有抗肿瘤效应的天然化合物;能够在体内及体外有效抑制人骨肉瘤的增殖、诱导凋亡、抑制迁移;UA的抗人骨肉瘤作用可能与其通过p38 MAPK/p53轴抑制Wnt/β-catenin信号转导有关。
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