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背景和目的弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是最为常见的一类非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma,NHL),约占比其发病率的30%-60%。迄今为止,利妥昔单抗和多药化疗联合疗法被公认是治疗NHL的标准疗法,患者可以获得长期生存和高反应性,但高达40%的患者会出现复发或者难治性疾病。近年来,嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor Tcell,CAR-T)疗法受到越来越多的关注,且在血液肿瘤治疗方面取得了显着的效果,但对于复发难治性血液疾病,仍有一半以上的患者对治疗没有持续的反应,急需新的治疗方案。IL-21是一种多效性的细胞因子,同时具有免疫调节和免疫治疗功能,可作用于多种免疫细胞,增强T细胞、NK细胞以及NKT细胞的抗肿瘤作用,还可以诱导B细胞的凋亡,作用于内皮细胞则抑制肿瘤血管的生成。已有研究结果证实,IL-21在肿瘤部位局部表达能增强先天和获得性的T细胞免疫。PD-1表达于T细胞表面及初级B细胞表面,而肿瘤细胞则高表达PD-L1,通过PD-1/PD-L1的结合引发T细胞的程序性死亡,从而使得肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视,实现免疫逃逸。研究发现,阻断PD-1/PD-L1的结合,大多数肿瘤都有反应。本课题拟在CD19 CAR-T,即CAR19-T细胞上共表达IL-21和分泌性PD1-Fc融合蛋白。人PD-1的胞外区与IgG1的Fc段连接成融合蛋白,既能起到阻断PD-1/PD-L1的作用,又能与巨噬细胞、NK细胞表面Fc受体结合,激发ADCC,发挥多重抗肿瘤作用,以增强CAR19-T细胞杀伤肿瘤细胞的效果,为复发难治DLBCL提供新的CAR-T细胞治疗方法。方法本课题是在以CD19为靶点的二代CAR的基础上,运用基因工程技术,构建出三种可表达目的基因的重组质粒:PEF-KCAR19-IL21、PEF-KCAR19-PD1Fc以及PEF-KCAR19-IL21-PD1Fc。使用慢病毒的三代包装系统,制备出四种CAR-T细胞,用细胞杀伤实验(LDH法)检测CAR-T细胞对DLBCL细胞系的杀伤效果,并建立弥漫大B细胞淋巴瘤皮下异种移植瘤动物模型,体内检测CAR-T细胞的效果。结果1.成功制备了四种 CAR-T 细胞:CAR19-T、CAR19-IL21-T、CAR19-PD1Fc-T以及CAR19-IL21-PD1Fc-T细胞,各种CAR-T细胞的CAR19阳性率在40%-60%之间。2.DLBCL细胞系OCI-Ly8和OCI-Ly3为靶细胞,各种CAR-T细胞与靶细胞共培养,发现都能有效杀伤靶细胞,各种CAR-T细胞对OCI-Ly8的最高杀伤效率接近90%,对OCI-Ly3的最高杀伤效率接近80%。3.在OCI-Ly8和OCI-Ly3皮下异种移植瘤模型中,与对照组相比,CAR19-IL21-T细胞组和CAR19-IL21-PD1Fc-T细胞组治疗效果最好,可以有效抑制肿瘤生长;CAR19-T细胞组和CAR19-PD1Fc-T细胞组尽管也有效果,但仅能延缓肿瘤生长。结论综上所述,本课题构建了四种CAR-T细胞:CAR19-T、CAR19-IL21-T、CAR19-PD1Fc-T以及CAR19-IL21-PD1Fc-T细胞,并初步验证了其体内外的功能,其中CAR19-IL21-T细胞组和CAR19-IL21-PD1Fc-T细胞组有更强的抗肿瘤作用,为CAR-T疗法提供了一个新的方案,为更深入的研究奠定了基础。