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胶质瘤是人类最常见的原发性颅内肿瘤。尽管目前胶质瘤联合治疗的手段包括手术切除、放射治疗和化疗，但近二十年来恶性胶质瘤患者预后仍无明显改善。随着肿瘤生物学和分子遗传学的进展，人们逐渐认识到：和人体其他部位的肿瘤一样，胶质瘤发生发展主要是原癌基因的激活与抑癌基因的突变缺失并由此产生一系列基因异常和动态演进的结果。 我们以往的研究表明：EGFR基因扩增和过表达是恶性胶质瘤发生发展的一种早期的始动事件。EGFR的过表达可以通过PI3K使下游AKT通路的活性上升，AKT被PI3K磷酸化后在肿瘤细胞的增殖和侵袭性生长中发挥关键作用。但到目前为止，AKT基因在胶质瘤中的表达及其在肿瘤恶性进展中的作用尚未深入研究。因此，本课题首先从AKT2及其相关基因的蛋白表达研究入手，然后进行反义和显性负调节AKT2治疗胶质瘤的体外实验，最后利用大鼠C6荷瘤模型进行了反义AKT2 cDNA治疗胶质瘤的动物实验研究，以期进一步了解AKT在胶质瘤中的作用以及阻断EGFR-PI3K-AKT通路对胶质瘤恶性进展的影响。 课题研究计划 本课题第一部分研究了50例胶质瘤标本AKT2及其相关基因的表达状况，并进一步在表达水平分析了EGFR，p-AKT，AKT2，MMP2/9和Ki67之间的相关关系及其与胶质瘤恶性程度之间的联系。以p-AKT代表PI3K的活性状态，以MMP2/9为侵袭指标，Ki67指数为增殖活性指标，应用免疫组化方法研究了EGFR、AKT2、MMP2/9和Ki67的表达，应用蛋白印迹方法研究AKT2和p-AKT的表达。 在本课题的第二部分，将逆转录病毒LXSN为载体的反义AKT2 cDNA和显性负调节AKT2(E299K)构建体-脂质体复合物直接转染人脑胶质瘤细胞系TJ905和鼠脑胶质瘤细胞系C6，LXSN载体转染组为空载对照。随机筛选阳性克隆并应用蛋白印记和原位杂交鉴定转染。MTT法和TUNEL法评价细 ’天津医科大学博士学位论文胞的增殖活性和凋亡，Transwell和球体培养法分析侵袭能力，球体培养和划痕实验研究细胞迁移能力，流式细胞法分析细胞周期，并进行GFAP的表达分析。 本课题第三部分为体内实验。应用立体定向技术将C6细胞和转染反义AKTZ cDNA的C6细胞种植到SD大鼠的右侧尾状核，分别命名为对照组和转染组。对颅内已经成瘤的大鼠进行反义AKTZ cDNA和LXsN空载体的立体定向治疗，并分别命名为治疗组和空载组。每组10只大鼠，观察指标包括实验大鼠的一般状态和生存时间，MRI动态监测荷瘤大鼠颅内肿瘤生长情况，并应用组织病理学方法检测肿瘤标本AKTZ，MMPZ/9，PCNA，G队P，和cyclin Dl的表达以及肿瘤细胞的凋亡情况。此外，将对照组1只2周的大鼠进行了大剂量、多途径联合反义AKTZ cDNA的实验性治疗，并选择1只反义治疗组4周大鼠进行了活化型AKTZ的实验性治疗。 结果 EGFR一PI3K一AKTZ一MMPZ/9一儿67的表达及分析 在胶质瘤中AKTZ的表达水平水平随肿瘤恶性程度增加而明显上升，低恶度胶质瘤与高恶度胶质瘤的蛋白表达水平有显著差异;p一AKT的研究结果与AKTZ结果相同。对EGFR、AKTZ、MMPZ/9和Ki67的免疫组化分析发现:上述指标在胶质瘤中的表达阳性率和表达水平随肿瘤恶性程度增加而增加，在低级别和恶性胶质瘤之间存在显著性统计学差异:此外相关分析发现EoFR，p一^盯，A盯2，MMPZ/9和儿67之间存在着显著性的关系。上述研究结果表明:EGFR一PI3K一AKT通路对胶质瘤的恶性进展作用显著，激活这条通路可以促进肿瘤细胞增殖和侵袭这两种重要的恶性表型。此外，阻断EGFR一PI3K一AKT通路可以成为阻止胶质瘤恶性进展的关键策略，因而AKTZ可能是胶质瘤基因治疗的一个侯选基因。 体外研究 C6细胞和TJgOS细胞在AKTZ构建体转染后应用蛋白印记和原位杂交鉴定转染成功。与对照组和空载组比较，转染反义或显性负调节AKTZ构建体后胶质瘤细胞增殖抑制率和增殖能力明显受到抑制，并可诱发细胞凋亡;同时肿瘤细胞MMPZ/9的活性下降;细胞周期分析表明出现GO/GI阻滞，GEAP表达上调。 体内实验 对照组和空载组的平均生存时间分别为17.8士0.92天和17.5士1.10天， 2 天津医科大学博士学位论文两组间生存时间没有显著性差别。反义AKTZ cDNA治疗组大鼠生存时间明显延长，在治疗120天后仍有3只大鼠生存;转染组在60天时有4只动物存活，生存时间也明显延长。MRI检查发现对照组和空载组全部成瘤;但转染组在4周有4只没有肿瘤生成，治疗组在4周时有3只肿瘤消失。对照组1只大鼠在第2周时MRI检查证实形成右测半球巨大肿瘤，对这只实验动物进行了颅内、肌肉各20ug的反义AKTZ cDNA一脂质体复合物治疗。治疗后动态MRI检测发现颅内肿瘤逐渐缩小，治疗4周后肿瘤消失。治疗后第4周时对1只带有残留病灶的动物进行颅内原位sug活化型AKTZ质粒DNA一脂质体复合物治疗，治疗后动态MRI检查发现颅内同侧缩小的肿瘤逐渐增大，该动物于治疗后7时周时死亡。免疫组化研究发现:转染组和治疗组AKTZ表达下降或消失，peN