Rap1GAP抑制黑色素瘤VEGF自分泌和旁分泌机制研究

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目的:构建高表达Rap1GAP的黑色素瘤细胞系,研究Rap1GAP的高表达对黑色素瘤成瘤的影响及其机制。探讨高表达Rap1GAP的黑色素瘤细胞中,Rap1GAP对黑色素瘤细胞的合成、分泌VEGF,以及抑制VEGF作用的机制,并研究VEGF对黑色素瘤细胞行为学的影响。探讨高表达Rap1GAP的黑色素瘤细胞旁分泌VEGF的功能的作用,以及其对黑色素瘤的血管内皮细胞的影响。方法:以pcDNA-Rap1GAP-Flagged质粒和pcDNA3.1质粒转染黑色素瘤细胞,将上述细胞皮下注射于裸鼠建立肿瘤模型;比较不同Rap1GAP表达水平细胞成瘤生长的差异;通过免疫组化染色比较不同Rap1GAP表达水平下,新生血管的数量;应用Epac、PD98059以及LY294002等工具药物激活或抑制Rap1及其下游信号分子,用免疫印迹方法测定相关蛋白表达水平;并在不同条件下,用MTT方法比较VEGF对黑色素瘤细胞生长和增殖的作用及机制;用Transwell和酶谱分析检测其迁移能力的改变,TUNEL染色检测细胞凋亡等生物行为学改变。收集不同Rap1GAP水平的黑色素瘤细胞培养基上清,用ELISA方法检测培养基上清中的VEGF含量;用此培养基上清交叉培养内皮细胞,比较不同Rap1GAP水平的内皮细胞对其反应的差异:并研究黑色素瘤细胞培养基上清对内皮细胞中Rap1GTP水平的影响。并用Western Blot检测血管形成相关蛋白的表达水平差异。结果:高表达Rap1GAP的黑色素瘤细胞在成瘤瘤体体积,新生血管数量上较正常表达Rap1GAP的细胞显著下降;进一步研究表明,在高表达Rap1GAP的黑色素瘤中,HIF-α和VEGF表达显著下降。细胞免疫印迹结果与组织检测结果相同,体外实验同样表明,Rap1GAP可以抑制Rap1GTP的水平,同时降低HIF-α和VEGF的表达。Epac在体外实验中可以促进VEGF和p-ERK表达,但是这一效果可以被Rap1GAP和PD98059取消;VEGF在体外试验中可以增加Rap1活性,从而活化ERK和Akt通路,但这种作用同样为Rap1GAP抑制;进一步研究表明,VEGF可以抑制黑色素瘤中的凋亡蛋白,如Caspase3、Caspase 9的表达,并通过增加Cyclin D1等蛋白的表达而促进细胞增殖,同时提高MMP-9、MMP-2活性;细胞学实验结果与分子生物学实验结果一致,上述作用在高表达Rap1GAP的黑色素瘤细胞中均被抑制。ELISA结果显示,高表达Rap1GAP的黑色素瘤细胞培养基上清中,VEGF的含量较pcDNA3.1转染的细胞显著下降;而用黑色素瘤细胞培养基上清交叉培养后,Rap1GTP的水平较普通培养基培养下显著升高;同时,此升高作用可以被VEGF的抑制剂取消。结论:Rap1GAP对黑色素瘤的发生发展具有一定的抑制作用,其作用机制可能通过抑制VEGF和HIF-α表达。VEGF在黑色素瘤的生长过程中具有自分泌作用,其作用机制通过Akt和ERK途径实现;同时VEGF不断刺激黑色素瘤分泌而形成正反馈机制,从而使得细胞的增殖失控,最终导致肿瘤形成;ERK磷酸化后可以抑制VEGF的mRNA降解,从而在翻译水平上增加VEGF表达;Akt通路活化在黑色素瘤的发生发展过程中具有核心作用,并通过增加HIF-α表达而增加VEGF mRNA的转录水平;Rap1GAP可以抑制上述增加VEGF表达的翻译和转录作用;同时,Rap1GAP可以抑制VEGF刺激细胞引起的下游效应蛋白表达增加,而抑制VEGF的生物学效应。此外,黑色素瘤细胞能够通过旁分泌途径,诱导和趋化内皮细胞进入黑色素瘤,并诱导血管新生,获得满足肿瘤生长所需的营养。其机制可能与VEGF在内皮细胞中升高Rap1GTP水平相关。
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