【研究背景】遗传性痉挛性截瘫（Hereditary spastic paraplegia,HSP）是一组具有高度临床和遗传异质性的中枢神经系统退行性疾病,主要临床表现为双下肢进行性痉挛和肌无力。根据患者是否伴有其他神经系统疾病表现,分为单纯型和复杂型。单基因突变是HSP的主要发病原因,目前已发现88个HSP的致病基因以及超过100种HSP的致病突变。本课题组前期在一个中国近亲结婚的家系中发现了线粒体苯丙氨酰tRNA合成酶基因（Mitochondrial phenylalanyl-tRNA synthetase 2,FARS2）上一个新的纯合错义突变位点c.424G＞T（p.D142Y）,首次将FARS2确定为HSP的致病基因,该突变被收录于在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM）数据库中,并被命名为SPG77。FARS2基因编码线粒体苯丙氨酰tRNA合成酶（Mitochondrial phenylalanyl-tRNA synthetase,mt-Phe RS）,是线粒体氨酰tRNA合成酶（Mitochondrial aminoacyl tRNA synthetase,mt-aa RS）家族成员之一。该家族成员的经典功能为在线粒体翻译过程中,将20个氨基酸装载到同源的线粒体tRNA分子上,促进线粒体蛋白质的合成。与FARS2同家族的线粒体天冬氨酰tRNA合成酶基因（Mitochondrial aspartyl-tRNA synthetase 2,DARS2）、线粒体谷氨酰tRNA合成酶基因（Mitochondrial glutamyl-tRNA synthetase 2,EARS2）、线粒体甲硫氨酰tRNA合成酶基因（Mitochondrial methionyltRNA synthetase 2,MARS2）以及线粒体精氨酰tRNA合成酶基因（Mitochondrial arginyl-tRNA synthetase 2,RARS2）的突变,均被报道可导致人类线粒体疾病。此类患者往往中枢神经系统临床症状突出,同时可伴有心脏、肾脏或骨骼等其他器官或系统损伤。目前已报道文献显示,FARS2基因突变患者仅表现出神经系统相关症状,根据临床表现可分为:婴幼儿期癫痫性脑病、迟发性痉挛性截瘫和青少年期难治性癫痫。FARS2突变患者来源样本的生化检测结果普遍提示,细胞氧化磷酸化水平异常。此外,大量FARS2致病突变的体外实验研究及患者来源细胞的酶学检测均显示,mtPhe RS氨酰化活性降低或完全缺失,提示FARS2突变导致的酶功能缺陷可能是导致疾病的根本原因。然而,因缺乏相关动物模型及细胞模型,其具体分子机制尚不明确,临床上治疗该类疾病以对症治疗为主,缺乏有效的治疗手段,因此FARS2突变导致HSP致病机制亟待进一步研究。【研究目的】通过建立多种Fars2缺陷动物模型及细胞模型,模拟FARS2突变患者的临床表现及病理特征;利用多种模型研究Fars2缺陷是否通过引起线粒体功能异常,从而导致疾病的发生;利用Fars2缺陷细胞模型寻找在神经元生长过程中伴随改变的关键分子,为临床治疗靶点提供新的思路。【实验方法】1.利用CRISPR/Cas9技术构建全身性Fars2基因敲除及Fars2 c.424G＞T（p.D142Y）突变小鼠模型,通过杂交策略,获得纯合子小鼠。结合显微镜及H＆E染色等方法观察纯合子小鼠胚胎形态特点,并通过q PCR技术检测三胚层标志性分子在小鼠模型中的表达情况。2.利用CRISPR/Cas9技术构建Fars2 flox/flox小鼠模型,通过与Nestin-Cre转基因小鼠杂交获得中枢神经系统特异性Fars2基因敲除小鼠模型（c KO）。并通过尼氏染色和免疫荧光染色观察c KO小鼠大脑结构改变;TUNEL染色及Western blotting检测大脑组织中细胞的凋亡情况。3.在Tg（hb9:e GFP）转基因斑马鱼受精卵中,利用显微注射Morpholinos构建fars2基因敲减斑马鱼模型。显微镜下观察fars2基因敲减斑马鱼的形态学表型;通过运动轨迹追踪及触碰逃避实验分析fars2基因敲减斑马鱼的行为学改变。4.通过shRNA慢病毒转染的方式构建Fars2基因敲减的小鼠皮层原代神经元模型,通过免疫荧光染色观察神经元突起的生长情况;TUNEL染色及Western blotting检测神经元的凋亡情况。5.利用Northern blotting检测c KO小鼠大脑皮层组织及体外Fars2敲减神经元中苯丙氨酸tRNA的氨酰化水平;利用Western blotting检测线粒体电子传递链复合物及线粒体基因组编码蛋白亚基的表达水平、q PCR检测线粒体mRNA表达情况。6.检测c KO小鼠大脑皮层组织、Fars2敲减原代神经元以及Fars2敲减PC12细胞中线粒体膜电位、ATP、ROS和NAD+的水平变化,用于反映线粒体生物学功能的改变;利用透射电镜技术观察线粒体超微结构改变;通过Seahorse细胞能量代谢分析系统综合分析Fars2敲减后PC12细胞中线粒体的代谢能力,并利用Annexin V/PI染色检测PC12细胞系凋亡情况。7.对shRNA-Fars2慢病毒转染后不同生长时期（转染后1 d、3 d、5 d、7 d和10 d）的小鼠皮层原代神经元进行转录组学测序,富集差异表达基因,分析Fars2基因敲减对神经元生长过程中关键分子及下游通路的影响。【研究结果】1.全身性Fars2基因敲除小鼠及Fars2 c.424G＞T（p.D142Y）突变纯合子小鼠于胚胎发育早期、神经发生之前停止发育。2.中枢神经系统特异性Fars2基因敲除小鼠可发育至胚胎晚期,但出生后即死亡;随小鼠胎龄的增加,大脑皮层组织表现出神经元进行性凋亡,并伴随着小胶质细胞活化、皮层结构变薄及脑室增大的现象,这与已报道的部分FARS2基因突变患者脑部影像学显示皮质萎缩和白质减少的表型相一致。3.在fars2基因敲减斑马鱼模型中,可以观察到斑马鱼胚胎发育畸形、体轴弯曲;脊髓运动神经元轴突明显缩短、突起分支分布无序;自主运动能力降低、对触碰刺激应答不灵敏的现象,与人类FARS2基因突变引起的痉挛性截瘫临床症状相似。4.在细胞模型中,随体外培养时间的增加,Fars2基因敲减小鼠皮层原代神经元进行性凋亡;神经突起生长缓慢且分支发育受阻。5.Fars2缺陷通过扰乱线粒体苯丙氨酸tRNA的氨酰化过程,抑制线粒体基因组编码蛋白质的合成,从而导致线粒体电子传递链中复合物I、III和IV表达水平下降。6.Fars2缺陷导致细胞内ATP及NAD+水平下降、ROS堆积、线粒体膜电位降低、线粒体呼吸氧耗量下降、细胞凋亡增加;超微结构显示线粒体肿胀、嵴断裂;提示线粒体功能受损。7.转染后不同时间点转录组学差异表达基因富集分析提示Fars2基因缺陷可以引起细胞周期、轴突髓鞘化相关通路及NF-κB信号通路的异常激活;且动力蛋白激活蛋白亚基分子Dctn3是神经元中Fars2缺陷的潜在下游分子。【研究结论】本课题通过构建多种Fars2基因缺陷的动物模型,成功模拟了FARS2基因突变导致的遗传性痉挛性截瘫患者临床表现;并结合体外细胞模型,揭示了FARS2基因突变引发神经退行性疾病的机制:Fars2缺陷扰乱了线粒体苯丙氨酸tRNA的氨酰化过程,从而抑制线粒体基因组编码蛋白质的翻译,使线粒体电子传递链复合物表达水平下降、线粒体功能受损,而线粒体功能的异常抑制了神经元突起的生长,最终导致神经元凋亡,诱发神经炎症;多时间点转录组学结果分析初步提示,细胞周期、轴突髓鞘化相关通路及NF-κB信号通路和潜在下游分子Dctn3在Fars2缺陷引发的神经元退化过程中发挥重要作用,可能为FARS2基因突变患者临床干预靶点的研究提供线索。