论文部分内容阅读
目的：本研究以小鼠MII期卵母细胞为材料进行玻璃化冷冻,与正常体外受精的胚胎为对照,比较了不同玻璃化冷冻液对MII期卵母细胞冻融的效果,探讨了冷冻后植入前胚胎发育进程中5-甲基胞嘧啶(5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5-fC)、5-羧基胞嘧啶(5-caC)的动态变化,以及TET蛋白与基因组表达表观调控关系,这些信息将为今后研究卵母细胞冷冻后胚胎发育过程中表观调节分子机制提供有效的参考。方法：试验分为两组,将KM品系雌性小鼠经过促排卵的获得MII期卵母细胞冻-融后行体外授精植入前胚胎作为试验组,以未冷冻的体外受精植入前胚胎作为对照组,采用间接免疫荧光法检测各组植入前胚胎5-mC与5-hmC、 5-fC、5-caC和TET蛋白(Tet1,2,3)的动态变化模式,并通过RT-PCR对获得的各时期(原核期：2h、4h、6h、8h、10h、2,卵裂期：2-Cell、4-Cell、8-Cell、Morula、 E-B、EXP-B)胚胎进行TET基因的定量分析,比较冷冻前后的变化规律。结果：(1)商品化组与自配组存活率、卵裂率和囊胚发育率均无显著差异(P>0.05),但两组与对照组的卵裂率和囊胚发育率比较差异极显著(P<0.01)。(2)利用5-mC与5-hmC抗体共染植入前各时期不同发育阶段的胚胎发现5-mC和5-hmC的荧光信号在冷冻组与IVF组间差异不显著(P>0.05)。5-mC的荧光信号在原核期从2h开始逐渐减弱至12h最低；卵裂期从2-Cell期开始逐渐减弱,到EXP-B期降至最低。而5-hmC的荧光信号原核期从2h开始逐渐增强,至12h最强；卵裂期从2-Cell期开始逐渐减弱,到8-Cell期降至最低且差异显著(P<0.05),又从8-Cell期开始逐渐增强至EXP-B期最强。冷冻组胚胎从4h开始雄原核5-mC开始向5-hmC转变,12h时5-hmC荧光信号达到最大,且主要存在于雄原核中,而IVF组胚胎从6h开始雄原核5-mC开始向5-hmC转变。(3)利用5-mC与5-fC抗体共染植入前各时期不同发育阶段的胚胎发现5-mC和5-fC的荧光信号在冷冻组与IVF组间差异不显著(P>0.05)。5-mC的荧光信号在原核期从2h开始逐渐减弱至12h最低；卵裂期从2-Cell期开始逐渐增强,到8-Cell期升至最强,之后又开始逐渐减弱至EXP-B期最低；而5-fC的荧光信号原核期从2h开始逐渐减弱至8h最低,随后又开始回升,到12h升至最强,其中6h与8h均显著低于其他原核期胚胎(P<0.05)。两组卵裂期胚胎从2-Cell期至8-Cell期均发生了DNA去甲基化现象,8-Cell期5-fC信号表达最低,随后开始升高,到EXP-B期最高,出现了重新甲酰基化。(4)利用5-mC与5-caC抗体共染植入前各时期不同发育阶段的胚胎发现5-mC和5-caC的荧光信号在冷冻组与IVF组间差异不显著(P>0.05)。5-mC的荧光信号在原核期从2h开始逐渐减弱至12h最低；卵裂期从2-Cell期期开始逐渐减弱至EXP-B期最低；而5-caC的荧光信号原核期从2h开始逐渐减弱至6h最低,随后又开始回升,至12h最强,其中6h均显著低于其他原核期；卵裂期从2-Cell期开始逐渐减弱至8-Cell期最低,随后又开始逐渐增强至EXP-B期最强。两组原核期从8h开始雄原核5-mC向5-caC转变,12h时雄原核5-mC荧光信号几乎消失,5-caC荧光信号达到最大并主要存在于雄原核中。两组卵裂期从2-Cell期至8-Cell期均发生了DNA去甲基化现象,8-Cell期5-caC信号表达最低,随后开始升高,到扩张囊胚时期最高,出现了重新羧基化。(5)卵母细胞冷冻组植入前期胚胎Tet1、Tet2、Tet3蛋白的荧光信号与IVF组相比无显著性差异(P>0.05)。Tetl蛋白在原核期从2h期开始逐渐减弱,到12h期降至最低；卵裂期从2-Cell期开始逐渐增强,到EXP-B期升至最强,而Tet2蛋白的荧光信号则是到E-B期升至最强。原核期Tet3蛋白的荧光信号从4h到10h信号逐渐加强,到12h降至最低；卵裂期冷冻组2-Cell期显著高于IVF组(P<0.05)。(6)TET基因在小鼠MII卵母细胞、精子、植入前期胚胎中表达情况如下：Tet1基因在小鼠MII卵母细胞、精子、原核期及2-Cell期胚胎中表达量非常低,但4-Cell和8-Cell期胚胎中表达量较高且IVF组显著高于冷冻组(P<0.05),随着胚胎的发育其表达量逐渐降低,其中冷冻组桑椹期胚胎高于IVF组；Tet2基因在小鼠MII卵母细胞冷冻组与IVF组植入前期胚胎中均有表达,其中IVF组MII期卵母细胞显著高于冷冻组(P<0.05),而桑椹期胚胎中表达量则是冷冻组显著高于IVF组(P<0.05)；Tet3基因在MII期卵母细胞和原核期表达量较高,在早期卵裂期胚胎中表达量较低,其中冷冻组MII期卵母细胞高于IVF组,而原核期胚胎中表达量则是IVF组高于冷冻组且无显著差异(P>0.05)。结论：(1)运用自配的冷冻-解冻液成功建立了昆明小鼠MII期卵母细胞冻融技术体系,获得了稳定、有效的冻融后的体外受精植入前期胚胎。(2)利用5-mC与5-hmC、5-fC、5-caC抗体共染MII期卵母细胞冷冻和非冷冻体外受精植入前期胚胎,建立了其着床前发育阶段DNA修饰的动态表达谱。(3)卵母细胞冷冻组植入前期胚胎Tet1、Tet2、Tet3蛋白的荧光信号低于IVF组,并建立了着床前发育阶段TET蛋白的动态表达谱。(4)Tet1基因在冷冻组与IVF组中MII卵母细胞、精子、原核期及2-Cell期胚胎中呈现低表达,Tet1参与调控IVF组小鼠4-Cell期和8-Cell期胚胎发育阶段5-mC到5-hmC的转变过程；Tet2基因在小鼠MII卵母细胞冷冻组与IVF组植入前期胚胎中均有表达,Tet2参与调控桑椹期胚胎发育过程中5-mC向5-hmC转变：Tet3基因在冷冻组与IVF组的MII期卵母细胞和原核期表达量较高,在早期卵裂期胚胎中表达量较低,Tet3基因参与调控原核时期阶段胚胎发育过程中5-mC向5-hmC转变,并发生了雄原核DNA的主动去甲基化。