海葵鱼不仅是珊瑚礁生态系统中的重要成员,同时也是人工繁育最为成功的海水观赏鱼之一。身为以等级地位分化作为社会群体构架的群居性鱼类,为了适应复杂的栖息环境并产生更多的后代,海葵鱼演化出了多种生态适应性策略。其中海葵鱼与海葵存在互利共生关系,是海葵鱼个体得以在自然界中生存下来的有力保障,而前人的研究表明海葵鱼通过存在于体表的厚厚的粘液层来抵御海葵刺细胞毒性,以作为共生的基础,但其体表粘液是否还具有其他的生理生态功能目前仍待研究。此外,海葵鱼还具有雌雄同体先雄后雌的性别发育特征,在自然海域中,通常由一对功能性雌鱼和雄鱼,再加上0-4条性别未分化个体组成的社会群体共同生活。“一夫一妻”雄性先熟的模式是海葵鱼在自然环境中最优的繁殖机制,性别未分化个体的存在为亲鱼缺失提供了及时的补充。而调控海葵鱼这种繁殖模式的分子基础目前亦未获全面性的解析。因此,本研究以克氏双锯鱼（Amphiprion clarkii）作为研究对象,从体表粘液免疫和性别发育调控两个角度对其生态适应性机制进行深入探讨,具体的结果和主要结论如下:1.克氏双锯鱼体表粘液的免疫活性及生态适应性作用本研究检测了克氏双锯鱼体表粘液中6种免疫相关酶（溶菌酶、蛋白酶、抗蛋白酶、组织蛋白酶B、碱性磷酸酶和过氧化物酶）的活力,发现溶菌酶、蛋白酶、抗蛋白酶和碱性磷酸酶的活力要显著低于大多数已经报道的其他海水鱼类。同时,体表粘液具有显著的抗革兰氏阴性菌活性,尤其是对副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的抑菌和杀菌活性最强,并通过引起菌体变形、聚集、细胞膜破裂和内含物外泄等发挥杀菌作用。体表粘液的杀菌效果具有明显的时间和剂量依赖性,同时表现出良好的酸碱耐受性和热稳定性。此外,体表粘液还具有很强的抗虫活性,通过引起虫体细胞表面泡状突起、细胞膜破裂、细胞核肿胀和细胞骨架变形等一系列变化,导致细胞内含物外泄而杀灭刺激隐核虫。因此,我们推测克氏双锯鱼体表粘液中可能存在某种全新的阳离子抗菌肽以助其抵抗细菌和寄生虫的威胁,这对于克氏双锯鱼适应群体模式下的社会地位竞争与生存环境至关重要。2.克氏双锯鱼性腺发育及其与血清性类固醇激素的相关性克氏双锯鱼的性腺呈两叶非对称状,生殖上皮内包含了精子/卵子发生各个时期的细胞类型。雄性克氏双锯鱼性腺为精卵巢结构,性腺可分为精巢组织部分和卵巢组织部分,两部分间无基膜相隔。在精巢组织部分,镶嵌着分散的初级卵母细胞,与雌性性腺中的卵母细胞结构没有差异,卵母细胞与精小囊或精子之间无特殊的膜结构或结缔组织相隔;在卵巢组织部分,可见大量处于核仁外周期或更早期的卵母细胞,卵母细胞之间可见有进一步发育成精巢组织的小叶状结构。雌性克氏双锯鱼的性腺全部为卵巢结构,无任何精巢组织或精细胞的存在。克氏双锯鱼的性腺结构决定了其性别发育的方向只能从雄性到雌性,而雌性个体无法再逆转为雄性。T在未分化期的含量最高;在雄性期,随着性腺的发育成熟,含量显著上升;在雌性期也有少量表达,但不随性腺发育而变化。结果表明,T不仅具有促进克氏双锯鱼雄性性腺发育成熟的作用,同时对幼鱼的竞争行为和雌性个体的统治行为和领地防御行为均有促进作用。11-KT在未分化期和雄性期的含量变化趋势与T类似,因此在此时期其作用可能与T相同。但与T不同的是,11-KT在雌性期几乎不表达,表明其对雌性的行为和性腺发育均不发挥作用。E2和DHP的表达模式与其他大多数硬骨鱼类相似,E2的含量随着雌性性腺的发育而显著升高,在成熟雌性阶段达到最高,在雄性发育过程中没有显著性变化;DHP的表达则呈“双峰”形,即在成熟雄性期和成熟雌性期的含量最高,在其他阶段无显著性差异,说明E2具有促进卵黄积累的作用,而DHP则在卵母细胞和精子细胞的最终成熟过程中发挥作用。以上研究结果表明性类固醇激素的含量不仅与性腺发育相关,同时与社会群体结构、个体所处的社会层级和社会行为等的联系也较为密切。3.克氏双锯鱼不同发育期性腺的转录组分析本研究对克氏双锯鱼不同发育期的性腺进行了转录组分析,发现性别未分化期性腺和雄性期性腺的基因表达模式较为相似,而与雌性期性腺的差异较大,这与其先雄后雌的发育模式相符;不同发育期的差异表达基因主要参与个体代谢、发育等生物学过程,具有催化、蛋白结合和转录调控等多方面功能。在差异表达的基因中,我们筛选出了 19个被注释到参与鱼类性别分化和性腺发育过程的基因,其中有多个基因的表达模式与其他鱼类存在较大差异,暗示着它们在克氏双锯鱼中可能行使不同的生理功能。其中,Sox8基因在雄性期上调表达,可能与雄性性腺的发育有关;Foxl2,Cyp19a1a,wnt4a,NR5A1a,gnb2,gnb4,gng2,Pgr,lipeb和hsd3b7基因均在雌性期上调表达,可能通过调控类固醇激素合成相关通路参与雌性性腺发育过程;Raraa也在雌性期上调表达,可能通过结合视黄酸分子启动雌性性腺的发育;Col4a1和Col6a1同样在雌性期上调表达,可能与卵巢组织的维持和发育有关;Ar和NR0B1基因仅在雌性期上调表达,可能参与维持雌性个体社会地位的生理行为调控;skib基因的表达在雄性期下调至雌性期又显著上调,推测可能通过调控骨形态发生蛋白bmp15的表达对雌雄性腺发育起相应的调控作用;而表达下调的Amh和tdrp基因可能主要参与克氏双锯鱼性腺组织的早期发育。4.克氏双锯鱼性别调控关键基因分析成功克隆获得了克氏双锯鱼Vasa、Dmrt1、Foxl2和Foxl3基因cDNA序列,并对这四个脊椎动物性别调控的关键基因在克氏双锯鱼中的组织分布和性腺表达模式进行了探讨。结果发现,Vasa基因特异性地仅在性腺组织中有表达,且在未分化期性腺中表达量最高,主要表达于早期生殖细胞内,包括精原细胞、初级和次级精母细胞,以及卵原细胞、卵黄前期各阶段的卵母细胞。结果表明Vasa基因对克氏双锯鱼性腺的发育不具有调控作用,其主要功能可能是参与调控早期生殖细胞的发育和分化过程。Dmrt1基因仅在性腺组织高表达,在其他组织中仅有少量或几乎不表达,且在成熟雌性性腺中的表达量显著高于其他发育时期。在雄性性腺中,Dmrt1基因表达于精原细胞、初级和次级精母细胞、Sertoli细胞、核仁外周期及发育更早的卵母细胞中;在雌性性腺中,Dmrt1基因在皮层小泡期及发育更早的卵母细胞中均能检测到表达信号。结果表明,Dmrt1基因在克氏双锯鱼性腺发育中的作用可能有别于其他鱼类,除了对雄性性腺的早期发育有着至关重要的作用,对雌性性腺的发育可能也有一定的促进作用。Foxl2和Foxl3为旁系同源基因,在鳃和性腺中均有很高的表达水平。在鳃中,它们可能保留了共同祖先基因在调控躯体新陈代谢方面的功能。在性腺中,Foxl2基因仅在雌性性腺中表达,且成熟雌性的表达量高于未成熟雌性,仅能在卵黄前期和卵黄积累期的卵母细胞周围的颗粒细胞中检测到信号。结果表明Foxl2基因在克氏双锯鱼中与其它大多数硬骨鱼相似,可能在颗粒细胞的分化和卵巢功能的维持方面起作用。在鱼类中,目前有关Foxl3基因的研究仍然十分有限。在本研究中Foxl3基因在克氏双锯鱼未成熟雌性性腺中表达量最高,其次是未分化性腺,其他三个时期的表达量间无显著差异。在精原细胞和核仁外周期及发育更早期的卵母细胞中均可检测到Foxl3信号。我们推测,Foxl3基因可能参与了鱼类生殖干细胞的早期分化,并通过某种反馈机制诱导生殖干细胞的性逆转式分化。