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研究背景血吸虫病(Schistomiasis)是一种可以导致严重慢性损害的寄生虫病,流行于全球约1/3的国家和地区,严重危害疫区人畜健康,阻碍当地经济发展。经过多年防治,目前我国人群和耕牛血吸虫感染率等疫情指标总体已处于历史最低水平,但各地疫情下降速度不均衡,上海、福建、广东、浙江、广西5省(市、自治区)已消灭血吸虫病。云南、四川、江苏已达到传播控制标准。但湖南、湖北、江西、安徽湖区4省仍为日本血吸虫病的主要流行区。针对我国当前的血吸虫病流行趋势,国家提出了以控制传染源为主的综合防治新策略,控制虫卵传染源的扩散以作为当前现场防治的重要措施。十多年来,经本课题组大量实验研究证实：日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原26-28kDa(SIEA26-28kDa)和成虫抗原31-32kDa(AWA31-32kDa)分子免疫动物后,可诱导动物产生较强的抗虫卵胚胎发育和抗雌虫生殖产卵的作用。如果采用免疫的方法达到减少感染宿主虫卵排放污染,降低血吸虫病危害的目的不失为一种经济有效地防治措施。我们从两种天然抗原中分别选取SjRPS4与SjCB构建了pVAX1/SjRPS4·CB双价DNA疫苗,并经动物实验证实,双价疫苗可以诱导机体产生更好的抗日本血吸虫病免疫保护效果。为进一步提高抗日本血吸虫病疫苗的免疫保护效果本课题拟通过重新改造疫苗载体以提高其表达水平,添加细胞因子类免疫佐剂,以观察是否可以诱导机体产生更好的抗日本血吸虫病免疫保护效果。研究目的构建及鉴定高效真核表达载体pVAX1/SjRPS4·CB、 pVAX1/IL-18;大量制备pVAX1/SjRPS4·CB、pVAX1/IL-18并免疫小鼠,以检测pVAX1/IL-18是否可以加强pVAX1/SjRPS4·CB抗病疫苗的免疫保护效果。研究方法1、高效表达载体pVAX1/SjRPS4·CB与pVAX1/IL-18的构建及鉴定以pET32a/SjRPS4-SjCB、pET28a/IL-18质粒为模板,对SjRPS4·CB、IL-18基因进行PCR扩增,酶切后与真核质粒载体pVAXl连接,然后转化入DH5α大肠杆菌中,对阳性克隆进行菌液PCR,质粒酶切及测序鉴定。将鉴定后质粒转染至293T细胞中,RT-PCR检测其mRNA水平表达情况。2、pVAX1/SjRPS4·CB与pVAX1/IL-18免疫小鼠抗日本血吸虫病效果的观察大量制备真核疫苗pVAX1/SjRPS4·CB、pVAX1/IL-18。只免疫小鼠,于免疫后3W腹部贴片感染小鼠。采用ELISA法检测小鼠特异性抗体诱导水平及IFN-γ、IL-4细胞因子水平；脾脏指数及淋巴细胞增殖实验,小鼠脾脏淋巴细胞增殖水平；小鼠肝组织石蜡切片HE染色及Masson染色分别用来观察肝脏虫卵肉芽肿大小及虫卵周围胶原沉积情况；小鼠体内成虫计数计算减虫率,肝肠组织、及雌虫子宫内虫卵计数以计算肝、肠减卵率及每雌减卵率。研究结果1、通过菌液PCR、质粒酶切及测序鉴定结果均显示高效表达质粒序列与预期序列一致,两个质粒插入片段翻译起始处均含有ANNATGG序列,RT-PCR结果显示重组载体在真核细胞内有明显表达,且表达量高于未改造质粒,证明高效重组质粒pVAX1/SjRPS4·CB、 pVAX1/IL-18构建及表达成功。2、pVAX1/SjRPS4·CB、pVAX1/IL-18联合免疫小鼠后,诱导机体上调IFN-γ表达,诱导Th1型细胞增殖,增强Th1型免疫反应,提高减虫率,肝、肠减卵率及每雌子宫减卵率,减小肝脏虫卵肉芽肿体积,减少虫卵肉芽肿周围纤维增生减少,而且联合免疫组诱导机体产生的特异性抗体水平高于单独免疫组。以上结果说明IL-18可以通过加强Th1型免疫反应增强pVAX1/SjRPS4·CB疫苗抗日本血吸虫病的免疫保护效果。结论1、成功构建高效真核表达载体pVAX1/SjRPS4·CB、pVAX1/IL-18。2、pVAX1/IL-18可以通过增强Th1型免疫反应来加强pVAX1/SjRPS4·CB疫苗抗日本血吸虫病的免疫保护效果。