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双酚A（Bisphenol A,BPA）是一种化学合成的环境内分泌干扰物,广泛用于聚碳酸酯和环氧树脂等高分子材料制作。塑料制品中的BPA在温度、时间或酸碱度改变下得以释放,引起动物机体各个系统功能障碍,影响动物的生长发育。B PA相关研究也是近年来的研究热点之一,它不仅影响内分泌系统的正常功能,还破坏生物体氧化稳态。褪黑素（Melatonin,MLT）作为一种抗氧化剂,能有效清除体内氧自由基,缓解细胞损伤并维持细胞稳态。本研究以羊肾细胞（FLK-BLV）为主要研究对象,检测BPA、MLT以及BPA与MLT共处理对FLK-BLV细胞活力、细胞凋亡、氧化应激和细胞自噬的影响,意在探究MLT对BPA诱导FLK-BLV细胞凋亡和氧化应激的保护作用,并揭示MLT对BPA诱导细胞凋亡的保护机制。主要的研究结果如下:1.MLT对BPA诱导FLK-BLV细胞凋亡的影响Cell Counting Kit-8（CCK-8）结果显示,BPA（150 μM）处理 6 h 细胞活力显著下调（P＜0.05）,当MLT浓度大于30 μM时,细胞活力显著下调（P＜0.05）,MLT（30 μM）预处理显著逆转了 BPA诱导的细胞活力下调（P＜0.05）。Hoechst33258染色检测细胞凋亡显示,BPA处理组凋亡细胞数量增多,MLT预处理减少凋亡细胞数量。实时定量PCR（qRT-PCR）结果显示BPA处理组中促凋亡基因Bax和Caspase-3 mRNA表达均显著上调（P＜0.05）,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达显著下调（P＜0.05）,MLT预处理逆转了凋亡基因的表达。蛋白免疫印迹法（Western Blot）结果显示BPA处理显著上调促凋亡蛋白Cyto-C、cleaved-PARP 和 cleaved-Caspase-3 表达（P＜0.05）,尽管 Bax、Bcl-2 的表达无统计学意义,其蛋白表达有上调和下调的趋势,而MLT预处理逆转了凋亡蛋白表达。2.MLT对BPA诱导FLK-BLV细胞氧化应激的影响采用2’,7’-二氯荧光黄乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针对细胞染色,检测BPA和MLT对细胞线粒体活性氧含量的影响,结果显示BPA处理可以显著增加细胞线粒体活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量（P＜0.05）,MLT预处理显著减少细胞线粒体ROS含量（P＜0.05）。一致地,流式细胞术检测结果表明BPA处理可以显著增加细胞线粒体ROS含量（P＜0.05）,MLT预处理以及BPA、MLT和NAC（N-乙酰半胱氨酸,NAC）三者共处理显著减少细胞线粒体ROS含量（P＜0.05）。Mito-tracker Green荧光探针染色进一步表明BPA处理显著促进线粒体损伤（P＜0.05）,MLT预处理可以显著缓解线粒体损伤（P＜0.05）。此外,BPA处理显著上调细胞中脂质过氧化物丙二醛（MDA）水平（P＜0.05）,并显著抑制超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）活性（P＜0.05）,而MLT预处理逆转了这些酶的表达。3.MLT通过调节FLK-BLV细胞自噬水平缓解BPA处理造成的细胞凋亡分别设置不同时间和不同浓度梯度BPA处理FLK-BLV细胞,Western Blot检测自噬相关蛋白,结果显示BPA以浓度和时间依赖方式显著上调LC3-Ⅱ和p62蛋白表达（P＜0.05）,表明BPA抑制了自噬体成熟。进一步研究显示,BPA处理组自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和p62表达显著高于对照组（P＜0.05）;与BPA处理组相比,BPA和CQ共处理组LC3-Ⅱ和p62蛋白表达略有增加,而BPA和Torin2共处理显著抑制p62蛋白表达（P＜0.05）,表明BPA处理阻断了自噬通量。Western Blot检测自噬相关蛋白显示,BPA处理显著促进LC3-Ⅱ和p62蛋白表达（P＜0.05）,MLT预处理显著抑制p62蛋白表达（P＜0.05）。用CQ阻断自噬通量后,MLT预处理未能缓解BPA诱导的自噬通量受阻,LC3-Ⅱ和p62蛋白表达高于BPA和MLT共处理组,表明MLT可以通过促进自噬缓解BPA诱导的自噬通量受阻。此外,Western Blot检测凋亡相关蛋白显示,BPA处理显著上调Bax和cleaved-Caspase-3蛋白表达（P＜0.05）,并显著抑制Bcl-2蛋白表达（P＜0.05）,而MLT预处理逆转了凋亡相关蛋白的表达;但在BPA、MLT和CQ共处理组中,MLT未能逆转Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase-3蛋白表达,其水平与BPA处理组相似。流式细胞术结果显示,BPA处理显著促进细胞凋亡,凋亡率为25.77%（P＜0.05）,MLT预处理显著抑制细胞凋亡,凋亡率为12.44%（P＜0.05）;但在BPA、MLT和CQ共处理组中,MLT未能逆转BPA诱导的细胞凋亡,凋亡率为16.5 9%。综上所述,本研究结果表明BPA（150μM）处理FLK-BLV细胞6h显著下调细胞活力,造成细胞凋亡、氧化损伤并阻断细胞自噬通量,而MLT预处理可以通过促进细胞自噬缓解BPA诱导的细胞凋亡和氧化损伤。本试验进一步探究了 BPA对细胞的毒性作用,并为临床上MLT在BPA诱导细胞损伤中发挥的重要作用提供了依据。