背景和目的随着环境的恶化和老龄化社会到来,肺癌发病人数呈逐年上升趋势,肺癌的复发和转移是其致死的主要原因,因此,解释肺癌转移的分子机制是肺癌防治的关键。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated Macrophage,TAM)极化分型与肿瘤的发生发展密切相关;巨噬细胞分为M1型和M2型;具有可塑性和异质性等特点;随着周围环境的不同而分化成不同的分型,其中M2型巨噬细胞可促进肺癌细胞的增殖和转移。多数研究表明,肿瘤细胞的能量代谢以糖酵解为主,其产生的原因不仅仅与原癌基因的激活(AKT、c-Myc、ErbB2及RAS等)和抑癌基因的突变(如PTEN及P53等)相关,也与肿瘤的免疫微环境中的多种免疫细胞具有相关性。在肺癌的发生初期,肿瘤细胞主要通过糖酵解为自身提供能量,浸润的巨噬细胞以M1型为主,其主要作用是抑制肿瘤生长。随着肿瘤的发生发展,在晚期肿瘤组织中,部分肿瘤细胞通过脂肪酸代谢为自身提供大量能量,此时M2型巨噬细胞逐渐占据主导地位,便于分泌各种细胞因子协助肿瘤细胞抵抗外界不良环境,促进肿瘤细胞侵袭迁移;即肿瘤的发展进程也是巨噬细胞由M1型向M2型转变的过程。胸腔积液是肺癌的并发症之一,也是晚期肺癌的重要特征,胸腔积液中含有丰富的细胞代谢物、蛋白,核酸等。而乳酸为糖酵解途径的最终产物的乳酸,在胸腔积液含量明显增高,实验室在前期研究结果表明:胸腔积液的巨噬细胞分型与肺癌的发展进程密切相关;恶性程度高的胸腔积液来源的巨噬细胞M2表型较炎性表型的胸腔积液明显升高。因此本课题在前期研究工作的基础上,基于代谢组学结合分子生物学技术,研究肺癌患者胸腔积液中的小分子乳酸对巨噬细胞的极化分型的影响,旨在阐明乳酸在低氧条件下调控巨噬细胞极化的不同类型,进而促进肺癌转移的分子机制,为肺癌治疗提供新思路。方法1、收集郑州大学第一附属医院超声穿刺科初次诊断未进行任何治疗的胸腔积液132例,全程放于冰盒内,立即于4℃,3000 rpm离心,取上清存入-80℃冰箱,对沉淀中的淋巴细胞进行提取。2、标记CD14,CD163,7AAD等marker,运用流式细胞术检测胸腔积液中的淋巴细胞中CD14~+、CD163~+的M2巨噬细胞占CD14~+巨噬细胞的比例;3、根据临床病理诊断的金标准,取200例胸腔积液中诊断明确,无其他合并症的患者的50例癌性胸腔积液和80例炎性胸腔积液,运用乳酸试剂盒检测乳酸的表达量,并检测差异代谢物的表达量与M2巨噬细胞的比例,患者的预后之间的关系,并运用TCGA数据库进行验证。4、从健康人外周血中分离CD14~+细胞,培养7天后分别在低氧和常氧环境中以梯度浓度加入乳酸(0,12.5mM,25mM、37.5mM和50mM),孵育24 h后,运用流式细胞术和PCR两种方法分别检测M2巨噬细胞的比例;并运用非靶向代谢组学分析其差异代谢物和代谢通路。5 MPE与BPE中小分子代谢物成分分析及通路分析。结果1、流式细胞术结果表明MPE中M2巨噬细胞的比例为27.7±2.373(%),明显高于BPE,8.91±1.327(%);2、用乳酸和乳酸脱氢酶试剂盒分别定量检测MPE和BPE标本,结果表明BPE中乳酸和乳酸脱氢酶的含量分别为2.54±0.285(m M)和216.7±33.29(U/L);MPE中乳酸和乳酸脱氢酶的含量分别为5.24±0.594(mM)和539.2±100.2(U/L),用spss软件进行分析,结果显示BPE和MPE上清中乳酸和乳酸脱氢酶的含量具有显著性差异,乳酸的含量与CD14+CD163+/CD14+的比例呈正相关,与临床患者的预后也密切相关。3、体外实验细胞系水平验证乳酸的浓度与M2巨噬细胞的比例有相关性随着乳酸浓度的提高,M2型巨噬细胞的比例增高。4、乳酸对巨噬细胞的影响的代谢组学结果显示:乳酸通过调节巨噬细胞的代谢重编程,花生四烯酰乙醇酰胺、环吡酮、异亮氨酸、亮氨酸、棕榈酰丝氨醇、腺嘌呤、反式肉桂酸、柠康酸、2-丙基戊酸、苯丙氨酸、EPA、肉豆蔻酸、三乙胺、MG(0:0/18:1(9Z)/0:0)等代谢产物发生改变,乳酸能通过与巨噬细胞表面G蛋白偶联受体GPR81结合,引起去甲肾上腺素增高,激活PI3K-AKT和MAPK通路等途径驱使巨噬细胞像M2方向极化,并导致患者的不良预后。这一结果在对良恶性胸腔积液的代谢组学检测以及TCGA数据库分析中得到了佐证。结论乳酸可以通过与巨噬细胞表面G蛋白偶联受体GPR81结合,引起去甲肾上腺素增高,激活PI3K-AKT和MAPK通路等途径驱使巨噬细胞像M2方向极化,并导致患者的不良预后。