本研究论文是以组蛋白去乙酰酶(HDACs)为作用靶点，运用基于受体结构的药物设计方法，进行虚拟筛选，通过对先导化合物进行结构优化，合成了三个系列共计49个具有全新骨架结构的HDACs抑制剂，并对其进行了体内外生物活性评价和构效关系讨论。对CDKs和VEGFR2的蛋白结构进行分子模拟，为化合物设计提供理论依据。全文共分为五个部分进行分章论述。　　 研究背景肿瘤(tumor)是仅次于心脑血管疾病的严重威胁人类生命健康的第二大杀手。目前，我国恶性肿瘤的发病率以每年2.5％的速度增长，死亡率每年递增约1.3％。靶向性抗肿瘤药物具有针对性强，副作用小的优点，成为当今研发的热点。　　 组蛋白去乙酰酶(HDACs)自上世纪70年代起逐渐被人们发现与肿瘤的发生、发展密切相关。到目前为止，共有18个亚型的HDACs被发现，根据它们序列的同源性将其分为四类。HDACs通过去乙酰化组蛋白和非组蛋白底物，影响蛋白质的稳定性、蛋白质-蛋白质之间的相互作用和蛋白质-基因之间的结合。通过调控基因的转录，影响染色质的状态和功能，调节细胞内信号的传导，影响细胞的生长、周期和分化。　　 随着人们对HDACs作用机制的深入研究，越来越多的HDAC抑制剂(HDACIs)被开发出来用于治疗炎症、感染和神经系统疾病，但绝大多数HDACIs被用于治疗肿瘤。它们的抗肿瘤机制包括引起肿瘤细胞的细胞周期阻滞、抑制肿瘤细胞周围的血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞的运动性和迁移能力以及肿瘤细胞的DNA修复能力等。很多高活性的HDACIs正处于不同时期的临床试验中，其中Zolinza和Istodax被FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤。目前，开发高效、低毒的HDACIs已经成为抗肿瘤治疗的热点课题。　　 HDACIs的抗肿瘤活性已经不是制约其走向市场的最主要因素，而改善它们的药物动力学参数是目前开发HDACIs的重要研究内容。很多化合物在临床前研究中具有很好的抗肿瘤活性，但是在临床研究中因为较差的ADMET性质而失败。本论文通过虚拟筛选的方法，寻找全新的HDACIs骨架，并对其进行结构改造发现了高活性的先导化合物，通过引入不同的取代基调节先导化合物的脂水分配系数，对先导化合物进行结构优化，开发出了两个系列结构新颖、高效的HDACIs。　　 靶向HDACs的虚拟筛选和结构优化本论文以HDAC8的晶体结构为受体，进行了基于配体药效团和基于受体结构的虚拟筛选。首先以成药五原则筛掉Specs化合物数据库中不符合要求的分子，再通过构建的基于TSA的药效团模型对化合物库进行进一步的精炼。得到的化合物通过FlexX对接到HDAC8的活性位点，考察它们的打分值和结合构象。最终购买了结构新颖，与受体有很好结合模式，易于结构改造的小分子化合物。在活性测试中，化合物02对HDAC8具有很好的抑制活性，但是在抑制肿瘤细胞生长的测试中，发现购买的化合物的抗增殖效果很不明显。　　 基于虚拟筛选的结果，我们对筛选到的化合物02进行了结构改造，增强其活性，特别是抗增殖活性。设计的化合物结构以羟肟酸为锌离子螯合基团(ZBG)，以苯环结构为链结构(linker)，在苯环上引入的芳香酰胺或磺酰胺为表面识别结构(externalmotif)。其中含苯甘氨酸的结构4h在酶活和抗增殖测试中表现出了最好的活性。4h对Hela细胞核提取物的抑制活性是0.14μM(SAHA，0.17μM)，在抑制肿瘤细胞生长的MTT测试中，4h对U937，HCT116，K562，HL60，MCF7，PC3的抑制活性分别为1.85，12.12，2.67，2.02，12.70，4.93μM。　　 先导化合物的结构优化通过分析HDAC2活性位点的表面结构图，我们发现其催化中心的下方有一个疏水性的口袋，而且口袋周围还分布着极性氨基酸残基。通过对化合物4h的结构和与受体的结合构象进行分析，我们的优化思路是使设计的化合物的表面识别区域能够延伸到活性位点下方的口袋与其结合，通过分子对接研究我们设计了两个系列的新化合物。一个系列是将4h的Boc取代基换成芳香酰胺基或磺酰胺基，增强其疏水作用，另一个系列则引入很长的脂肪链linker。通过对接发现它们与HDACs有很好的结合模式。　　 在分子水平的酶活测试和细胞水平的抗增殖测试发现，新合成的化合物（D系列和L系列）在抑制酶活性方面有显著提高。D系列的化合物与4h相比不但在酶活水平上有了很大提高，而且其抗增殖活性也有很大改善，特别是对淋巴瘤和血液瘤细胞株(U937，K562和HL60)。在体内抗肿瘤活性测试中，通过给接种U937的裸鼠给药，发现化合物D17表现出了比上市药物SAHA更好的抗增殖活性，说明D17是具有临床开发价值的高活性的HDACIs类抗肿瘤药物。在抑制酶活的选择性测试中，我们发现D系列化合物对ClassⅠHDACs的抑制活性比HDAC6更好。虽然L系列的化合物在抑制酶活方面比4h有了显著提高，但是其抗增殖作用较弱，其原因可能是引入的脂肪链使其脂水分配系数变差，很难透过细胞膜进入细胞核发挥作用。　　 分子模拟指导先导化合物的发现计算机辅助药物设计(CADD)是20世纪80年代逐渐兴起的一门学科，通过将计算方法与化学结构信息和生物信息等结合起来用于化合物的设计。随着CADD方法的不断改进，其在药物研发的作用越来越明显。CADD的研究方法包括三维定量构效关系研究、对接、同源模建、药效团、虚拟筛选和分子动力学模拟等。这些方法在药物设计中的广泛应用大大降低了药物研发的成本和缩短了药物研发周期。本论文针对细胞周期依赖性激酶1(CDK1)和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）进行了一系列的分子模拟工作，开发全新的抗肿瘤药物分子骨架和指导化合物分子的设计。　　 细胞周期是一个高度有序的运转过程，这种高度有序的运转是通过Cyclin/CDKs复合物来实现的。从生物学角度来看，肿瘤表现为细胞增殖过度、分化受阻和凋亡障碍，细胞周期失调、信号传导途径异常，是一类渐进性细胞周期调控机制破坏的疾病。而肿瘤中上述细胞周期调控缺陷均是由Cyclin/CDKs失调直接或间接导致的。基于CDKs在调控肿瘤细胞增值与凋亡中的关键作用，抑制CDK可有效阻止癌细胞周期进程从而抑制肿瘤细胞增殖，以CDKs作为癌症的治疗靶点，被认为是治疗肿瘤的有效途径。　　 由于CDK1的三维晶体结构还没有解析出来，本论文首先运用同源模建的方法，以人源CDKs的晶体结构为模板，构建了CDK1的三维结构。通过将选择性CDK1抑制剂分子对接到CDK1的活性位点，预测抑制剂与配体的结合模式。将活性抑制剂Flavopiridol对接到CDK1活性口袋进行分子动力学模拟，研究在配体，受体相互作用中起关键作用的氨基酸残基。构建CDK1活性位点的药效团模型，总结与CDK1结合对抑制剂结构的需求。为下一步合理设计CDK1抑制剂提供思路。　　 VEGFR2是VEGF的主要功能受体，二者结合以后形成二聚体，酪氨酸发生自身磷酸化，激活并将细胞膜/细胞质激酶级联反应信号传递到细胞核，可引发内皮细胞的一系列变化，包括钙离子内流，IP3增加，血管内皮金属蛋白酶、凝血酶的产生，诱导整合素的表达，调节与纤维蛋白溶解和凝固的相关因子在内皮的表达。这些级联反应通过抗凋亡等机制调节内皮细胞的存活，促进新生血管生成并维持其完整性。VEGF刺激VEGFR2，介导肿瘤血管内皮细胞DNA合成和增殖。VEGFR2还参与VEGF介导的血管通透性改变。抑制VEGFR2是抗肿瘤治疗的新思路，它倾向于阻断肿瘤细胞的营养供给阻滞其生长和转移，而非直接杀伤肿瘤细胞。　　 本论文以VEGFR2为靶点进行了虚拟筛选，发现了全新的高活性的VEGFR2抑制剂骨架。首先用成药五原则对Specs化合物数据库进行了初筛。以VEGFR2晶体结构里的配体为模板，构建了四点的药效团模型，对化合物数据库进行了药效团匹配和构象合理性的筛选。通过FlexX对接，将筛选的化合物对接到VEGFR2的活性部位，保留打分值高和结合模式好的化合物。通过进一步的结合构象研究，脂水分配系数分析和结构新颖性评价，购买了16个化合物，对其进行活性测试。通过抑制管生成，MTT，动脉环实验测试发现了高活性VEGFR2抑制剂(12)。通过分子动力学模拟研究其与VEGFR2的结合模式，为下一步的结构优化提供了参考意见。　　 总结与展望本课题综合运用药物化学、化学生物学、计算机化学等前沿学科的交叉，以抗肿瘤研究领域的热点受体组蛋白去乙酰化酶HDACs为靶标，通过虚拟筛选技术发现活性抑制剂骨架，经过结构改造、合理设计和结构优化定向合成了三个系列共49个具有全新骨架结构的HDACs抑制剂。对所有目标化合物进行了分子水平的抑酶活性筛选，从中选取活性较好的化合物逐层进行细胞水平、动物水平的抗肿瘤活性测试，利用得到的构效关系信息对表现优异的化合物进行进一步的结构改造、修饰和优化。结果表明:苯甘氨酸骨架结构可以用来设计、合成具有体内外抗肿瘤活性的广谱HDACs抑制剂，目前得到的化合物D17的体内外抗肿瘤活性明显优于上市药物SAHA，对D17的进一步临床前评价和研究正在深入进行当中。运用计算机辅助药物设计手段，通过同源模建，分子对接，药效团模型和分子动力学模拟等技术指导化合物的合理设计。通过虚拟筛选技术发现全新的抑制剂骨架，并发现了高活性的VEGFR2抑制剂骨架。