类固醇激素对硬骨鱼类的生殖、生长、发育、新陈代谢以及内环境稳定都具有重要作用。而类固醇激素的合成需要一系列类固醇合成酶的参与。其中羟基类固醇激素合成酶3β-HSD2参与多个关键步骤,是类固醇激素合成过程中很关键的一种酶。目前,关于羟基类固醇合成酶在硬骨鱼类生殖中研究较少,仅有的研究也只是停留在克隆表达层面。淇河鲫,是一种天然的由雌核发育而来的三倍体鱼类。是银鲫在长时间的进化过程中形成的一个地方种群,因产于河南淇河而得名。本实验以淇河鲫为实验对象,通过应用RACE技术克隆获得3β-HSD2基因全长,并从m RNA水平以及蛋白水平检测其在成鱼不同组织、胚胎发育不同时期与性腺发育不同时期的表达。同时使用其抑制剂曲洛斯坦（Trilostane）处理淇河鲫仔鱼,观察性腺表型。并检测处理前后性别决定相关基因的m RNA表达水平,主要研究结果如下:1.克隆获取3β-HSD2基因全长。其c DNA全长为1723 bp,开放读码框长度为1104bp,编码367个氨基酸残基,预测相对分子质量为41.95 k Da,蛋白等电点值为6.50。5′非编码区长度为218 bp,3′非编码区长度为401 bp。通过系统进化分析可知,淇河鲫3β-HSD2与金鱼相似性最高,二者亲缘关系最近;氨基酸同源性比对结果显示,淇河鲫3β-HSD2具有羟基类固醇家族的辅酶结合位点GCGFLG（罗曼斯折叠:GXGXXG）以及酶激活位点YPKTK（YXXXK）。2.荧光定量PCR结果显示,3β-HSD2基因在脾中表达量最高,卵巢表达水平处于中等;在胚胎发育过程中,3β-HSD2的表达量长期处于中等水平,在出膜期达到最高;在性腺不同发育时期,在性别决定与分化的关键时期30-40 dah（孵化后天数:days after hatching）,3β-HSD2表达水平升高十分明显;在卵巢发育各时期中,3β-HSD2表达水平逐步升高,在120 dah达到高峰,并稳定维持至720 dah。以上研究结果表明,该基因可能在胚胎发育阶段、性别决定与分化阶段以及维持卵巢发育等过程中发挥了一定作用。3.我们制备3β-HSD2的多克隆抗体,用于Western Blot（WB）验证其在各组织的表达水平,用于免疫组化来确定3β-HSD2在实验对象性腺的细胞定位。实验结果表明,所制备的多克隆抗体在实验对象卵巢总蛋白中可特异性识别到42 k Da左右的单一条带,表明制备的3β-HSD2抗体具有良好的特异性。WB结果表明,3β-HSD2在卵巢等组织中具有中等表达水平,在成鱼脾中表达量最高,与m RNA水平的检测结果是一致的。4.免疫组化结果显示,在15 dah可检测到3β-HSD2在性腺体细胞中特异性表达,在35-80 dah 3β-HSD2可检测到在卵巢的卵原细胞、卵母细胞及体细胞表达,100-120 dah可检测到3β-HSD2在卵巢的卵原细胞和体细胞表达,150-720 dah可检测到3β-HSD2在体细胞表达。3β-HSD2在生殖细胞及体细胞的“广泛表达”,说明它可能在性腺中具有多种作用,参与多种信号通路,并且在卵巢发育及维持过程中发挥一定作用。5.为进一步探究羟基类固醇脱氢酶3β-HSD2在淇河鲫性别决定中的作用,本研究中使用3β-HSD2抑制剂Trilostane处理5 dah实验对象至80 dah,结果表明Trilostane处理可以诱导实验对象发生性逆转。免疫组化结果表明,3β-HSD2在性逆转的精巢间质细胞中表达,表明其可能在雄性的精巢发育中也发挥着一定作用;实时荧光定量PCR检测结果显示,经过Trilostane处理发现,淇河鲫3β-HSD2在性逆转精巢中表达量显著下调。同时检测性别决定信号通路中芳香化酶、β-链蛋白1、11β-羟化酶等关键基因,实验结果表明,雌性性别决定相关基因的表达显著下调,雄性性别决定相关基因的表达显著上调。表明Trilostane通过抑制3β-HSD2表达导致性逆转,性逆转后雌雄信号通路基因的表达量也随之变化。综上所述,本研究通过定量表达分析、蛋白定位、抑制剂处理等实验方法,证明了3β-HSD2可能参与了天然雌核发育三倍体淇河鲫雌性性别决定与分化以及卵巢发育与维持等过程。在雌激素合成过程中,3β-HSD2发挥重要的作用。本研究通过抑制3β-HSD2,使实验对象发生性逆转。因此本研究支持了“缺失假说”,在鱼类性腺分化早期,未出现雌激素,发育为雄鱼。