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研究背景及目的急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是起源于多能造血干细胞的恶性克隆性血液系统疾病,表现为白血病干细胞的恶性增殖而导致的造血细胞增殖分化能力受抑,从而引起一系列全身多脏器功能受累。具有较高的异质性,死亡率高,预后不良。目前的主要治疗多以标准化的化疗方案、造血干细胞为主,后者是潜在性治愈白血病的有效方案,近年来免疫疗法的研究也在进一步开展。研究表明,血管新生在白血病的发病机制中发挥着重要的作用。骨内膜存在的广泛血管网供给造血干细胞的增殖以及进一步分化,病理状态下,白血病细胞和血管内皮细胞相互作用,刺激生长因子的失衡进而导致病理性血管的形成,影响疾病的化疗敏感性及预后,增加耐药几率,同时会提高并发症的发病几率。升麻鳖甲汤原方来源于《金匮要略·狐惑阴阳毒病证治》,目前临床已用于皮肤病、免疫组织疾病等疾病治疗中,临床数据显示其具有调节免疫、抗炎等作用。根据中医辨证论治的理论基础,并结合临床实践经验,我们通过对升麻鳖甲汤原方进行加减后应用于血液系统疾病中,在一定程度上减少了化疗后不良事件(如造血受抑、免疫缺陷、胃肠道反应等)的发生率,提高化疗有效率,改善患者中医证候积分。本课题组在前期的实验研究中表明升麻鳖甲汤加减方(ShengMa BieJia Decoction,SMBJD)在荷瘤鼠体内具有抑制移植瘤生长的作用,体外研究显示其对急性髓系白血病细胞株具有细胞毒性作用,且通过MAPK通路诱导AML细胞的凋亡。鉴于白血病发病机制与血管新生之间的联系,本研究拟探讨SMBJD的抗白血病作用是否与其在AML中的抗血管新生作用有关,以及其中可能存在的分子作用机制。研究方法1.体内实验研究通过鸡胚尿囊膜实验观察不同浓度的SMBJD对体内微血管密度的影响;通过构建HL60荷瘤鼠模型研究不同浓度SMBJD对小鼠移植瘤瘤体组织的影响,采用免疫组织化学、蛋白免疫印迹技术(Western Blot,WB)和聚合酶链反应法(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测SMBJD介导抗血管新生的相关因素表达。2.体外实验研究高压液相质谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测升麻鳖甲汤加减方中的主要有效成分。利用MTT实验分别检测SMBJD对HUVECs和AML细胞株的细胞活性影响,根据结果提取经SMBJD干预AML细胞后无细胞毒性的药物浓度培养AML细胞提取上清液即为条件培养基(conditional medium,CM),MTT法检测CM对HUVECs的细胞活性影响;采用划痕实验、Transwell小室实验和体外管腔形成实验分别观察经SMBJD和条件培养基干预后的HUVECs的趋化、迁移及体外成管能力的变化;酶联免疫吸附实验检测AML细胞的VEGF分泌表达情况;利用WB和PCR技术检测相关蛋白和mRNA的变化。研究结果1.体内实验结果荷瘤鼠实验观察结果显示,不同浓度的SMBJD(20,40,80 g/kg)对荷瘤小鼠体重的影响组间无明显差异,瘤体体积随时间推移逐渐增大,给药组与对照组(生理盐水组)之间无明显差异;免疫组化标记结果中CD31和VEGFR2表达的受抑制,且抑制程度与给药浓度成正相关。鸡胚尿囊膜试验中证实,SMBJD对于体内微血管密度(microvessel density,MVD)具有削弱作用,且随着浓度增加而削弱作用逐渐增强。2.体外实验结果升麻鳖甲汤加减方HPLC结果显示,其中的有效成分分别为甘草苷(liquiritin),阿魏酸(ferulic acid),升麻素(cimifugin),异阿魏酸(Isoferulic acid)和甘草酸(glycyrrhizic acid)。细胞增殖活性检测结果显示,SMBJD在所给药剂量范围内(2,4,8 mg/mL)对HUVECs和AML细胞系均无明显细胞毒性。因此均选取2,4,8 mg/mL三个浓度作为后续实验的给药浓度。在非细胞毒性药物浓度的作用下,SMBJD干预后的HUVECs的迁移、趋化和体外成管能力均受到不同程度的抑制,且该抑制作用在8 mg/mL最为显著。无细胞毒性的SMBJD干预后的AML细胞培养上清即CM,对HUVECs亦无明显细胞毒性,但是削弱了 HUVECs的迁移、趋化和成管能力;ELISA结果显示,非毒性浓度的SMBJD抑制了 AML细胞系中血管内皮生长因子(Vascuoar endothelial growth factor,VEGF)的分泌。经内皮细胞刺激因子—VEGF165刺激后的HUVECs在SMBJD干预后,呈现出与给药浓度正相关的活性抑制,且这种抑制作用与不经VEGF165刺激相比有所下降;划痕、Transwell实验、体外管腔形成实验也受到抑制;WB和PCR结果均显示出,无论是SMBJD干预、VEGF165刺激还是条件培养基培养的HUVECs,VEGF、血管内皮生长因子受体-2(Vascuoar endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2)及 mRNA 的表达均受到负向调节作用,且具有统计学差异;另外,信号通路相关的PI3K、AKT及其磷酸化蛋白的表达和mRNA的调控也受到负导向作用,其中8 mg/mL的作用更显著。研究结论1.SMBJD体内具有减少鸡胚尿囊膜微血管密度的作用,下调荷瘤鼠模型瘤体组织中VEGF、VEGFR2和mRNA,以及免疫标记CD31、VEGFR2的表达;2.SMBJD体外抑制HUVECs的生理功能,抑制AML细胞中VEGF的分泌;3.条件培养基干预后的HUVECs,随条件培养基中SMBJD浓度的提升,VEGF、VEGFR2、P13K和AKT磷酸化蛋白以及mRNA的表达下降;4.SMBJD的抗血管新生作用的潜在机制可能与负调控AML细胞中VEGF的水平和PI3K/AKT通路有关。