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目的:本研究拟采用人肺腺癌SPC-A1细胞为研究对象,探讨毛蕊异黄酮与化疗药物顺铂联合后对肺腺癌SPC-A1细胞周期进程、凋亡、侵袭和转移的影响,并分析其阻滞细胞周期进程、诱导凋亡、抑制侵袭和转移可能的分子机制,明确毛蕊异黄酮联合顺铂后能否增加顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞的抑制作用的敏感性,以期为降低顺铂在肺腺癌治疗中的使用剂量,改善顺铂耐药,减轻化疗毒副作用提供新的思路。材料与方法:1毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞周期的影响1.1毛蕊异黄酮对肺腺癌SPC-A1细胞周期的影响。采用MTT法筛选毛蕊异黄酮作用浓度及时间。将终浓度为5、15、25、50、75、100μM毛蕊异黄酮分别作用SPC-A1细胞12、24、36、48 h后,在570nm波长处测定光密度值（OD值）,计算细胞增殖率及毛蕊异黄酮作用12、24、36、48h后的IC30值和IC50值,筛选毛蕊异黄酮最佳作用浓度和时间用于后续研究。采用FCM法检测不同浓度毛蕊异黄酮（0、25、50、100μM）分别作用SPC-A1细胞24小时后对细胞周期分布的影响。1.2毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞周期的影响。采用MTT法检测各组药物（毛蕊异黄酮50μM、顺铂20μM、毛蕊异黄酮50μM+顺铂20μM）分别作用SPC-A1细胞12、24、36、48 h后对细胞增殖抑制率的影响;采用FCM法检测各组药物分别作用SPC-A1细胞后对细胞周期分布的影响;进一步采用Western blot方法检测各组药物分别作用SPC-A1细胞后,细胞中CyclinD1、CDK4蛋白的表达水平,探讨毛蕊异黄酮联合顺铂后对肺腺癌SPC-A1细胞周期相关蛋白的影响。2毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞凋亡的影响及分子机制研究2.1毛蕊异黄酮对肺腺癌SPC-A1细胞凋亡的影响。采用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡时细胞核形态变化;采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测不同浓度毛蕊异黄酮（0、25、50、100μM）分别作用SPC-A1细胞12、24、36、48 h后对细胞凋亡率的影响。2.2毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞凋亡的影响及分子机制研究。采用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡时细胞核形态变化;采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测各组药物（毛蕊异黄酮50μM、顺铂20μM、毛蕊异黄酮50μM+顺铂20μM）分别作用于SPC-A1细胞12、24、36、48 h后对细胞凋亡率的影响;进一步采用Western blot方法检测各组药物分别作用SPC-A1细胞后,线粒体途径中Bcl-2、Bax、Cyt-c、Cleaved-caspase9蛋白表达水平及PTEN/P13K/Akt信号通路中PTEN、Akt、p-AKT蛋白表达水平,探讨毛蕊异黄酮联合顺铂诱导肺腺癌SPC-A1细胞凋亡可能的分子机制。3毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞迁移和侵袭的影响及分子机制研究3.1毛蕊异黄酮对肺腺癌SPC-A1细胞迁移和侵袭的影响。采用划痕实验和Transwell迁移实验检测不同浓度毛蕊异黄酮（0、25、50、100μM）分别作用SPC-A1细胞后细胞的迁移能力;采用Transwell侵袭实验检测不同浓度毛蕊异黄酮分别作用SPC-A1细胞后对细胞侵袭率的影响。3.2毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞迁移和侵袭的影响及分子机制研究。采用划痕实验和Transwell迁移实验检测各组药物（毛蕊异黄酮50μM、顺铂20μM、毛蕊异黄酮50μM+顺铂20μM）分别作用SPC-A1细胞后对细胞迁移的影响;采用Transwell侵袭实验检测各组药物分别作用SPC-A1细胞后对细胞侵袭率的影响。进一步采用Western blot方法及实时荧光定量PCR方法检测各组药物作用SPC-A1后,MMP2、MMP9蛋白及mRNA的表达水平,探讨毛蕊异黄酮联合顺铂抑制肺腺癌SPC-A1细胞迁移和侵袭的可能的分子机制。结果:1.毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞周期的影响1.1不同浓度毛蕊异黄酮对SPC-A1细胞周期的影响。MTT法结果显示,毛蕊异黄酮浓度低于15μM对SPC-A1细胞的增殖率无明显抑制作用,当浓度高于25μM,随着浓度的增加和时间延长,SPC-A1细胞的增殖率明显降低,且具有浓度和时间依赖性;当时间大于36h后,细胞的增殖率下降缓慢,与第48小时比较,无显著差异（p>0.05）,说明时间大于36h后,毛蕊异黄酮对SPC-A1细胞的增殖抑制作用具有浓度依赖性,但无时间依赖性。根据MTT实验计算细胞的IC30值和IC50值。第12、24、36、48h的IC30值分别是72.49μM、52.32μM、35.16μM、32.45μM;第12、24、36、48h的IC50值分别是124.34μM、101.30μM、99.02μM、97.47μM。FCM法结果显示,毛蕊异黄酮能够影响SPC-A1细胞周期分布,随着浓度的增加,S期细胞比例明显降低,G0/G1期细胞比例明显升高,说明毛蕊异黄酮能够抑制SPC-A1细胞的G1期进行G1/S期的转换,阻滞细胞周期进程。1.2毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞周期的影响及分子机制研究。MTT法结果显示,各实验组药物分别作用SPC-A1细胞后,细胞的增殖抑制率均明显上调;毛蕊异黄酮联合顺铂后对细胞增殖率的上调幅度明显高于顺铂单药组。FCM法结果显示,各实验组药物均可以抑制细胞的G1期进行G1/S期的转换,G0/G1期细胞比例明显升高,S期细胞比例明显降低;毛蕊异黄酮联合顺铂后,S期细胞比例的下降程度明显高于顺铂单药组。Western blot实验结果显示:各实验组药物分别作用SPC-A1细胞后,与对照组比较,细胞中CyclinD1、CDK4蛋白的表达水平均下调;毛蕊异黄酮联合顺铂组,细胞中Cyclin D1、CDK4蛋白的表达水平的下调程度明显高于顺铂单药组。说明毛蕊异黄酮联合顺铂后,对细胞周期的抑制作用更加明显,其作用机制可能是通过下调Cyclin D1、CDK4蛋白的表达水平实现的。2.毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞凋亡的影响2.1不同浓度毛蕊异黄酮对SPC-A1细胞凋亡的影响。Hoechst33258染色结果显示,毛蕊异黄酮作用SPC-A1细胞24h后,荧光显微镜下观察,正常细胞核呈弥散均匀蓝色荧光,出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光,颜色有些发白,随着毛蕊异黄酮浓度的增加,具有凋亡形态的细胞数目也增加。AnnexinV-FITC/PI双染法结果显示,随着毛蕊异黄酮浓度的增加和时间的延长,SPC-A1细胞的凋亡率明显增加,具有浓度和时间依赖性;当时间大于36h后,细胞的凋亡率下降缓慢,与第48小时比较,无显著差异,说明时间大于36h后,毛蕊异黄酮诱导SPC-A1细胞凋亡作用具有浓度依赖性,但无时间依赖性。实验结果表明,毛蕊异黄酮可以诱导SPC-A1细胞发生凋亡,且呈浓度依赖性。2.2毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞凋亡的影响及其分子机制。Hoechst33258染色结果显示,各实验组药物作用SPC-A1细胞24小时后,荧光显微镜下观察,与对照组比较,各实验组均出现细胞凋亡,表现为凋亡的细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光,有部分块状荧光,颜色有些发白,毛蕊异黄酮和顺铂联合组与顺铂单药组比较,细胞核形态发生明显变化,具有凋亡形态的细胞数目明显增加。AnnexinV-FITC/PI双染法结果显示,各实验组药物与对照组比较,均能上调SPC-A1细胞凋亡率;毛蕊异黄酮联合顺铂后细胞凋亡率明显高于顺铂单药组。进一步行Western blot实验结果显示:各实验组药物分别作用SPC-A1后,与对照组比较,线粒体途径中Bax、Cyt-c、Cleaved-caspase9蛋白的表达水平均上调,Bcl-2蛋白的表达水平均下调;PTEN/P13K/Akt信号通路中PTEN蛋白的表达水平均上调,p-AKT蛋白的表达水平均下调,Akt蛋白的表达水平无明显变化;毛蕊异黄酮联合顺铂后,Bax、Cyt-c、Cleaved-caspase9、PTEN蛋白表达水平的上调程度、Bcl-2、p-AKT蛋白的表达水平的下调程度,均明显高于顺铂单药组,Akt蛋白的表达水平与顺铂单药组比较无明显变化。说明毛蕊异黄酮联合顺铂后诱导SPC-A1细胞凋亡作用更加明显,其作用机制可能是通过调控线粒体途径相关因子Bcl-2、Bax、Cyt-c、Cleaved-caspase9蛋白的表达水平及PTEN/P13K/Akt信号通路中PTEN、p-AKT蛋白的表达水平来实现的。3.毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞迁移和侵袭的影响3.1不同浓度毛蕊异黄酮对SPC-A1细胞迁移和侵袭的影响。划痕实验及Transwell迁移实验结果显示,不同浓度毛蕊异黄酮作用SPC-A1细胞后,细胞划痕损伤愈合速度明显低于对照组,且具有浓度依赖性;穿过聚碳酸酯膜的细胞数量明显少于对照组,细胞迁移抑制率明显高于对照组,且呈浓度依赖性。Transwell侵袭实验结果显示,不同浓度毛蕊异黄酮作用SPC-A1细胞后,侵袭穿过聚碳酸酯膜的细胞数量明显少于对照组,侵袭抑制率明显高于对照组,且呈浓度依赖性。实验结果表明毛蕊异黄酮能够抑制SPC-A1细胞的迁移和侵袭,且呈浓度依赖性。3.2毛蕊异黄酮联合顺铂对肺腺癌SPC-A1细胞侵袭和转移的影响及其分子机制。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,各实验组药物与对照组比较,细胞划痕愈合速率明显降低,细胞迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数量明显减少,细胞迁移抑制率均高于对照组;Transwell侵袭实验结果显示,细胞侵袭穿过聚碳酸酯膜的细胞数量明显减少,细胞侵袭抑制率高于对照组。毛蕊异黄酮联合顺铂后,划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,细胞划痕愈合速率明显低于顺铂单药组,细胞迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数量明显少于顺铂单药组,细胞迁移抑制率高于顺铂单药组;Transwell侵袭实验结果显示,细胞侵袭穿过聚碳酸酯膜的细胞数量明显少于顺铂单药组,细胞侵袭抑制率明显高于顺铂单药组。Western blot及RTFQ PCR实验结果显示:各实验组药物分别作用SPC-A1后,与对照组比较,MMP2、MMP9蛋白及mRNA的表达水平均下调;毛蕊异黄酮联合顺铂后MMP2、MMP9蛋白及mRNA表达水平的下调程度明显高于顺铂单药组。说明毛蕊异黄酮联合顺铂对SPC-A1细胞侵袭和转移的抑制作用更加明显,其作用机制可能是通过下调MMP2、MMP9蛋白及mRNA的表达水平来实现的。结论:1.毛蕊异黄酮能够抑制肺腺癌SPC-A1细胞的增殖率,阻滞细胞周期进程,能够诱导细胞凋亡,抑制细胞的侵袭和转移。2.毛蕊异黄酮联合顺铂后对肺腺癌SPC-A1细胞周期进程的抑制作用较单药顺铂更加明显,其作用机制可能是通过下调Cyclin D1、CDK4蛋白的表达水平实现的。3.毛蕊异黄酮联合顺铂后诱导肺腺癌SPC-A1细胞凋亡作用较顺铂单药更加明显,二者有协同作用,其作用机制可能是通过调控线粒体途径相关因子Bcl-2、Bax、Cyt-c、Cleaved-caspase9蛋白的表达水平及PTEN/P13K/Akt信号通路相关蛋白PTEN、p-AKT蛋白的表达水平实现的。4.毛蕊异黄酮联合顺铂后对肺腺癌SPC-A1细胞迁移和侵袭作用较顺铂单药更加明显,其作用机制可能是通过下调MMP2、MMP9蛋白及mRNA的表达水平实现的。