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目的:研究苦参素(Matrine,MAT)对多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)的经典动物模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)急性大鼠模型的行为特征和脊髓的组织病理学影响,检测脑白质中OLIG2(少突胶质细胞)的凋亡(TUNEL)情况,大鼠脑白质中细胞凋亡执行蛋白酶caspase-3、小热休克蛋白HSPB5、致炎细胞因子白介素IL-1β的变化情况,线粒体凋亡关键蛋白OLIG2+Cytc+表达情况,少突胶质细胞中自噬相关蛋白OLIG2+Beclin1+和线粒体自噬TOMM20+LC3+表达情况,脑和脊髓中谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px及丙二醛MDA的含量测定;观察MAT对EAE大鼠并发症视神经炎(optic neuritis,ON)的组织病理学作用,检测视网膜中 Nrf2、SIRT1、PGC1α、TOMM20 与Brn3a 共表达情况。探索 MAT 对 EAE大鼠脑中少突胶质细胞线粒体自噬的作用机制以及对EAE并发症ON中线粒体生物合成的机制研究,旨在为治疗MS寻找潜在的作用机制,为MAT在临床的应用奠定理论基础。方法:1建立EAE大鼠模型在无菌环境下制备豚鼠全脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate,GPSCH),加入等量弗氏完全佐剂(complete freund adjuvant,CFA,含有 6 mg/mL的卡介苗)制成油包水抗原乳剂,随机选择20只6-8周雌性Wistar大鼠在其四肢足垫皮下注射抗原乳剂。2动物分组及干预采用随机数字表法将20只免疫后的Wistar大鼠随机分成两组(每组10只):EAE模型组(EAE+Vehicle)、MAT治疗组(EAE+MAT)。另外10只健康的未免疫的Wistar大鼠为正常组(Naive)。EAE+MAT组大鼠在免疫后第11天起每天给予250 mg/kg(6.7 mL/kg)MAT进行腹腔注射治疗,Naive组和EAE+Vehicle组大鼠在免疫后第11天起在相同时间点用等量生理盐水进行腹腔注射治疗,三组大鼠均干预至第17天。3收集实验标本在免疫后第18天,麻醉大鼠,心尖采血后用预冷的生理盐水进行心脏灌注,取眼球、视神经、脑和脊髓,一半浸泡于4%多聚甲醛中制成石蜡切片,另一半冻存于-80℃冰箱备用。4指标检测苏木素-伊红(HE)染色法与LFB染色法分别观察大鼠脊髓和视神经炎性细胞浸润情况和脱髓鞘情况,TUNEL染色检测少突胶质细胞凋亡,免疫荧光双染法检测 OLIG2+Cyt c+、OLIG2+Beclin1+、TOMM20+LC3+、Brn3a+Nrf2+、Brn3a+SIRT1+、Brn3a+PGC1α+、Brn3a+TOMM20+表达,Western Blot 法检测caspase-3、HSPB5、IL-1β 表达,比色法检测 GSH-Px、MDA 的活性。主要研究结果分为以下两部分:第一部分:苦参素通过抑制凋亡和增强线粒体自噬来保护少突胶质细胞1发病率Naive组大鼠无发病情况,EAE+Vehicle组大鼠有8只发病,发病率为80%,EAE+MAT组大鼠有7只发病,发病率为70%。Naive组大鼠发病率显著低于EAE+Vehicle组和EAE+MAT组,有统计学意义(P<0.05);EAE+MAT组大鼠发病率较EAE+Vehicle组无明显差异,不具有统计学意义(P>0.05)。2体重变化和神经功能学评分三组大鼠在免疫后初期体重均略有下降,Naive组大鼠从第3天开始体重稳步上升,其余两组大体均呈现先上升后下降的趋势,其中EAE+MAT组大鼠体重降低幅度明显低于EAE+Vehicle组(P<0.05)。Naive组大鼠神经评分始终为0。免疫后第17天,EAE+Vehicle组平均神经功能学评分显著高于EAE+MAT组(P<0.01)。3组织病理学变化Naive组大鼠的脊髓均未出现炎性浸润和髓鞘脱失现象,评分均为0。与Naive组大鼠相比,EAE+Vehicle组有严重的炎性浸润和大量脱髓鞘情况。EAE+MAT组大鼠炎症浸润评分和脱髓鞘评分均显著低于EAE+Vehicle组,差值具有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。4 TUNEL染色Naive组大鼠中枢神经系统中有少数的少突胶质细胞凋亡,而EAE+Vehicle组则出现大量凋亡细胞,二者相比,有统计学意义(P<0.001)。与EAE+Vehicle组大鼠相比,EAE+MAT组少突胶质细胞凋亡的数量明显下降(P<0.01)。5脑白质中Cytc、Beclin1、TOMM20和LC3的表达EAE+Vehicle组较Naive组大鼠脑白质中Beclin1、TOMM20和LC3表达显著降低(P<0.001),而 EAE+MAT 组 Beclin1、TOMM20 和 LC3 表达与EAE+Vehicle组相比显著升高(P<0.001)。与Naive组相比,EAE+Vehicle组Cytc表达明显升高(P<0.001),与EAE+Vehicle组相比,EAE+MAT组Cytc表达明显下降(P<0.01)。6脑和脊髓中caspase-3、HSPB5和IL-1β的表达情况EAE+Vehicle组较Naive组大鼠脑和脊髓中caspase-3、HSPB5和IL-1β表达显著升高(P<0.001),而 EAE+MAT 组 caspase-3、HSPB5 和 IL-1β 表达水平与EAE+Vehicle 组相比明显下降(P<0.001,P<0.001,P<0.01)。7脑和脊髓中GSH-Px、MDA的含量变化与Naive组大鼠相比,EAE+Vehicle组GSH-Px活性显著降低(P<0.001);与 EAE+Vehicle 组相比,EAE+MAT 组 GSH-Px 活性明显升高(P<0.001)。MDA含量的变化与GSH-Px相反。第二部分:苦参素在实验性视神经炎中通过激活SIRT1促进线粒体生物合成并降低氧化应激1发病率Naive组大鼠无发病情况,EAE+Vehicle组大鼠有7只发病,发病率为70%,EAE+MAT组大鼠有8只发病,发病率为80%。Naive组大鼠发病率显著低于EAE+Vehicle组和EAE+MAT组,有统计学意义(P<0.05);EAE+MAT组大鼠发病率较EAE+Vehicle组无明显差异,不具有统计学意义(P>0.05)。2体重变化和神经功能学评分三组大鼠在免疫后3天体重均连续下降,Naive组大鼠从第3天开始体重稳步上升,EAE+Vehicle组和EAE+MAT组大鼠体重均呈现先上升后下降的趋势,其中EAE+MAT组大鼠体重下降幅度明显低于EAE+Vehicle组(P<0.05)。Naive组的平均神经评分始终是0。免疫后第17天,EAE+Vehicle组平均神经功能学评分显著高于EAE+MAT组(P<0.01)。3组织病理学变化Naive组大鼠的视神经中均未出现炎性浸润和髓鞘脱失现象,评分均为0。和Naive组大鼠相比,EAE+Vehicle组有严重的炎性浸润和大量脱髓鞘情况。EAE+MAT组大鼠炎症浸润评分和脱髓鞘评分均显著低于EAE+Vehicle组,差值具有统计学意义(P<0.001)。4 视网膜中 Brn3a+SIRT1+、Brn3a+Nrf2+、Brn3a+PGC1α+和Brn3a+TOMM20+共表达情况与Naive 组大鼠相比,EAE+Vehicle 组 Brn3a+SIRT1+、Brn3a+Nrf2+、Brn3a+PGC1α+和 Brn3a+TOMM20+表达显著降低(P<0.001、P<0.01、P<0.001、P<0.001);与 EAE+Vehicle 组相比,EAE+MAT 组 Brn3a+SIRT1+、Brn3a+Nrf2+、Brn3a+PGC1α+和 Brn3a+TOMM20+明显升高(P<0.01)。结论:1 MAT对急性EAE大鼠有明显的治疗作用,可能是通过抑制少突胶质细胞凋亡,增强线粒体自噬,提高少突胶质细胞中线粒体抗氧化应激能力,从而减少少突胶质细胞凋亡实现的。2 MAT对EAE并发症视神经炎有较好的治疗作用,可能是通过激活SIRT1和PGC1α去乙酰化促进线粒体生物合成,以及Nrf2调控的抗氧化防御机制,来防止视网膜神经节细胞丢失实现的。