不同分子量黑莓多糖的制备、结构解析及其体外消化、酵解特性研究

来源 :华南理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cjfalx
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黑莓(Blackberry)又称露莓,是蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)的一种灌木。多糖是黑莓果实主要的生物活性成分,但目前关于黑莓多糖的精细结构解析、提取与改性对多糖产生的影响及黑莓多糖结构与其降血糖活性之间的构效关系尚不清楚。本论文首先研究了提取溶剂对黑莓多糖结构及其生物活性的影响;其次探究了黑莓多糖分子量对其α-葡萄糖苷酶抑制活性、消化及酵解特性的影响;再综合应用化学和现代仪器分析手段鉴定黑莓多糖的精细化学结构和溶液构象;最后联合硒化修饰及红细胞膜包覆制备具有核-壳双层结构的纳米硒粒子(RBC@BBP-24-3Se),并研究其对棕榈酸诱导Hep G2细胞糖/脂代谢紊乱的调节作用和机制,为开发一种新型的可用于改善糖尿病的硒补充剂提供理论依据。主要研究结果如下:(1)分别采用热水、0.1 M HCl溶液、0.1 M Na OH溶液和0.1 M Na Cl溶液提取黑莓多糖,制备的多糖分别命名为Hw、Ac、Al和Na,并对比研究了4种黑莓多糖的理化性质、结构特征和生物活性。Al提取得率最高为10.64%,Ac糖醛酸含量最高为62.76%;单糖分析表明各多糖的单糖组成差异较大,但均主要由半乳糖醛酸和阿拉伯糖组成;4种多糖的粒径和分子量分布各不相同,Hw和Na具有较大的粒径和分子量;红外光谱、三股螺旋结构、XRD及扫描电镜分析表明各多糖组分具有相似的官能团,但分子结构和表观形貌显著不同;流变分析表明高分子量的Hw和Na具有较大的表观粘度和较好的流变学特性;体外抗氧化实验、α-葡萄糖苷酶抑制实验及抗糖基化实验均表明高分子量的Hw和Na具有较好的生物活性;同时,糖醛酸含量较高的Ac具有较好的抗糖基化活性。结果表明,提取溶剂对黑莓多糖的理化性质、结构特征及生物活性具有重要影响。Hw和Na理化性质及生物活性近似,相比于盐溶液提取,热水提取更加经济环保,因此,在后续章节实验中采用热水提取黑莓多糖。(2)通过超声处理对热水提取的黑莓多糖进行降解,得到四个分子量不同的黑莓多糖组分,分别命名为BBP(591.39 k Da)、BBP-8(363.93 k Da)、BBP-16(249.51 k Da)及BBP-24(177.42 k Da)。结果表明,4种多糖的糖含量、单糖组成和主要官能团相似,均具有三股螺旋结构,表明超声降解并未破坏黑莓多糖的基本结构;BBP、BBP-8、BBP-16和BBP-24对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值分别为1.59、2.58、1.96和1.11 mg/m L,表明黑莓多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性与其分子量密切相关;此外,4种多糖均通过混合型抑制,诱导α-葡萄糖苷酶内部微环境的变化,降低α-葡萄糖苷酶的α-螺旋和β-转角含量,并增加自由卷曲结构含量,从而导致α-葡萄糖苷酶活性的降低。(3)通过体外模拟胃肠道消化实验,研究分子量对黑莓多糖消化特性及对油脂消化的影响。结果表明,各多糖经胃液消化后,分子量均无明显变化;但经肠液消化后,各多糖分子量显著降低,BBP、BBP-8、BBP-16和BBP-24的分子量分别降低77.48%、69.96%、56.86%和52.89%,表明胃肠道消化对高分子量多糖的影响更大;各组分黑莓多糖在整个消化过程均未检测到游离单糖,表明黑莓多糖并不能被胃肠道消化吸收;同时,各组分黑莓多糖的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性随着消化的进行而降低;此外,BBP、BBP-8、BBP-16和BBP-24对胆汁酸的结合能力分别为0.30、0.26、0.23和0.16 m M,对油脂吸附能力分别为265.84、141.37、76.52和32.77 mg/g;体外模拟脂质消化实验表明BBP-24、BBP-16、BBP-8和BBP与玉米油形成的乳液中释放的游离脂肪酸的量(%,w/w)分别为65.58%、55.77%、48.11%和34.88%,结果表明,高分子量黑莓多糖对胆汁酸和脂质的结合能力更强、对油脂消化分解抑制作用更显著。(4)通过体外粪便菌群发酵模型,研究分子量对黑莓多糖酵解特征的影响。结果表明,低分子量黑莓多糖具有更快的产气速率和碳水化合物消耗速率;高分子量黑莓多糖在酵解过程中分子量降解程度更大,产生的大分子量寡糖片段更多,且各多糖中单糖利用速率顺序为:葡萄糖>半乳糖>阿拉伯糖>半乳糖醛酸,体外酵解24 h后,葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖基本已被完全利用,半乳糖醛酸的利用率接近80%;各组分多糖发酵显著促进了短链脂肪酸(SCFAs)的产生,尤其是乙酸,低分子量多糖具有更快的产SCFAs速率,但分子量并不影响黑莓多糖最终SCFAs产率;此外,黑莓多糖发酵引起了酵解液中菌群多样性的变化,主要是Bacteroidetes比例的增加以及Firmicutes比例的减少,BBP、BBP-8、BBP-16和BBP-24酵解液中Bacteroidetes的占比分别为45.41%、47.50%、48.08%和50.09%,结果表明低分子量黑莓多糖对Bacteroidetes的增殖具有更好的促进作用。(5)通过DEAE-52纤维素柱层析法对黑莓多糖BBP-24进行分离纯化,得到分子量均一的多糖BBP-24-3,分子量为145.1 KDa;BBP-24-3由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖醛酸组成,且摩尔百分比含量分别为5.30%、3.60%和91.10%;甲基化和核磁共振分析结果表明BBP-24-3的主链是由→4)-α-D-Gal Ap-(1→的重复单元组成;动态光衍射、尺寸排阻色谱-多角度光散射、透射电镜和原子力显微镜分析表明多糖BBP-24-3在0.1 M Na Cl溶液中呈均匀的实心球构象;此外,BBP-24-3通过混合型抑制对α-葡萄糖苷酶表现出良好的抑制活性。(6)以黑莓多糖BBP-24-3(2 mg/m L)为表面修饰剂,制备出均一稳定的黑莓多糖纳米硒粒子(BBP-24-3Se),其粒径大小为167.1 nm;经红细胞膜包覆后,纳米硒颗粒(RBC@BBP-24-3Se)粒径增加至239.8 nm,呈现出明显的核-壳双层结构;当浓度为10μg/m L时,Hep G2细胞对RBC@BBP-24-3Se的吸收率是BBP-24-3Se的4.99倍;RBC@BBP-24-3Se能够有效保护棕榈酸诱导Hep G2细胞脂质氧化损伤,提高己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活力,促进Hep G2细胞对葡萄糖的消耗和糖原的合成,降低胞内总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量并增加高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量,并通过PI3K/AKT和AMPK信号通路改善棕榈酸诱导Hep G2细胞糖/脂代谢紊乱。
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