血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguinneus)是一种吸血性外寄生虫,主要寄生在哺乳动物、鸟类、爬行动物体表,也是多个细菌、病毒、寄生虫等病原体的传播媒介,给人类健康和畜牧业生产造成严重影响。近年来,由于耐药性和环境污染问题的出现,传统意义上药物控蜱方法已经渐渐被生物控蜱方法所替代,比如Bm86和Bm95疫苗的成功商业化。这就意味着,筛选分析蜱功能分子基因的重要性。MicroRNA作为一类内源性的非编码RNA,仅有18～25nt,广泛存在于动植物细胞中。这类特殊分子通过与靶标基因mRNA特定位点结合,抑制或促进该蛋白的合成及诱导该mRNA的降解,从而达到参与该基因表达调控的目的。现已证实,microRNA可诱导生物基因沉默,参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。本研究从已有血红扇头蜱miRNA数据库中筛选出与卵发育相关的miR-275基因,寻找调控靶基因的启动子等转录调控区域,预测靶标基因,采用RNA干扰及qRT-PCR方法对其真实性进行验证;PCR扩增靶标基因进行序列分析;选择功能区构建重组表达载体,进行体外原核表达及免疫反应的研究。miR-275作为重要的基因调控因子,分析其在血红扇头蜱不同发育阶段的表达水平具有重要意义。利用RNA干扰、实时荧光定量(qRT-PCR)、动物实验等方法共同分析miR-275调控靶标基因的作用机制。结果显示,卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)基因是miR-275重要的靶标基因。参考GenBank中微小扇头蜱(Rhipicephalus microplus)(登录号:EU086096)卵黄原蛋白核苷酸序列,设计特异性引物,扩增获得基因全长为1218bp的血红扇头蜱Vg基因序列,该基因与微小扇头蜱同类基因具有较高的同源性,达到93%;其次与变异革蜱、希伯来花蜱、肩突硬蜱同源性分别为85%、78%、62%。值得注意的是Vg基因包含一个221个氨基酸的Von Willebrand Factor tyeD(VWFD)区域,对该功能区设计特异性表达引物,进行体外原核表达。重组蛋白分子量为51kDa能与兔抗血红扇头蜱全蟀、兔抗长角血蜱全蜱、兔抗残缘璃眼蜱全蜱以及兔抗草原革蜱全蜱等阳性血清均出现不同程度反应。qRT-PCR方法检测血红扇头蜱不同吸血时期miR-275和Vg基因表达谱表现为负调控关而卵不同发育时期0～5天和9～13d时表现为正调控,在5～9d时呈现出负调控关系。RNA干扰结果显示,血红扇头蜱卵发育紊乱,具体表现在产卵量减少、孵化率减少、孵化时间延长、卵形态异常等。值得关注的是,miR-275还参与了蜱吸血的调控,而且是负调控作用,具体表现在随着蜱吸血时间的延长Vg基因的表达量逐渐降低而miR-275的表达水平逐渐升高。以上结果表明,miR-275参与了血红扇头蜱卵的发育及血液消化:卵的发育过程中当miR-275表达水平逐渐升高时,Vg基因的表达水平趋于降低。此时卵的形态、卵的孵化率及卵的粘稠性都有所降低,卵的孵化期也随之延长。血液消化方面,miR-275的表达一直处于高表达水平,当蜱虫开始吸血时,Vg基因开始参与血液的消化,其表达量在miR-275参与的调控作用下逐渐上调,直到蜱虫饱血脱落。该结果也可以通过Vg基因的RNA干扰实验得到验证。因此miR-275在参与血红扇头蜱血液消化以及卵发育中期方面是一种负调控机制,而在卵发育前期和后期处于正调控机制。该项研究填补了国内外关于蜱虫microRNA调控功能研究的空白,为下一步更详细解析其调控机制的研究奠定基础,为蜱虫的生物学防控措施的制定提供了理论依据。