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研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是导致痴呆最常见的病因,然而目前尚无有效的治疗方法可以阻止或者延缓疾病的进展。在探索散发性AD的发病机理的过程中,越来越多的证据表明胰岛素信号通路异常在AD发病中起着非常重要的作用。因此,以胰岛素信号通路为靶向治疗AD得到人们越来越多的关注。经鼻吸入胰岛素已经被证实可以改善健康受试者和AD患者的记忆和注意力,但这种保护作用的具体机制仍待阐明。我们前期的研究发现,给予AD转基因小鼠（3×Tg-AD小鼠）经鼻吸入胰岛素1周后,可以改善胰岛素信号通路异常,降低脑内Aβ40（amyloid beta,Aβ）的含量。但经鼻吸入胰岛素是否能够增加脑葡萄糖代谢,减轻神经炎症,改善突触功能,降低tau蛋白的磷酸化水平,进而改善认知功能障碍,有待我们进一步探索和研究。侧脑室注射链脲佐菌素（intracerebroventricular streptozotocin-injected,ICV-STZ）的大鼠模型,是一种被广泛应用的散发性AD（sporadic AD,SAD）的模型,表现为认知功能障碍和许多类似AD样的病理改变如胰岛素抵抗,脑代谢降低,神经炎症和tau蛋白过度磷酸化等。为了进一步研究经鼻吸入胰岛素对散发性AD的治疗作用,尤其是对认知功能、脑代谢及tau磷酸化的影响,我们采用ICV-STZ大鼠模型,连续经鼻吸入胰岛素6周（2U/天）后,检测各组大鼠的一般情况,行为学,脑葡萄糖代谢和分子生物学指标的改变,为进一步开展后期临床试验提供坚实的理论依据。研究内容和结果1.本研究中,我们将所有的大鼠随机分成三组:正常对照组（Con）,生理盐水组（STZ/Sal）和胰岛素组（STZ/Ins）。给药过程中监测三组大鼠的体重和血糖,发现三组大鼠血糖的变化无明显差异,生理盐水组和胰岛素组体重较正常对照组明显减轻。2.采用旷场实验（Open Field,OF）,物体识别实验（Object Recognition test,ORT）和水迷宫测试（Morris Water Maze,MWM）来评估三组大鼠的自主活动和认知功能。旷场实验中,ICV-STZ大鼠在旷场内活动经过的距离比对照组明显增加,表明其对环境的探究行为增加,经鼻吸入胰岛素后能降低该组大鼠的探究行为。物体识别实验中,ICV-STZ大鼠探究新物体的时间显著少于对照组,而胰岛素组与对照组之间没有明显差别,表明ICV-STZ大鼠短时记忆受损。在MWM的获得性训练（acquisition phase）中,三组大鼠的逃避潜伏期（Escape latency）和游泳速度（Swim speed）无显著差异;而在探查测验（probe trial）中,ICV-STZ大鼠在目标象限停留的时间和穿越原平台的次数明显低于对照组和胰岛素组,提示胰岛素能够改善ICV-STZ大鼠的空间记忆损害。3.我们用免疫印迹法检测了经鼻吸入胰岛素对ICV-STZ大鼠脑内tau蛋白磷酸化的影响。结果显示与对照组相比,ICV-STZ大鼠脑内tau蛋白多个位点磷酸化水平升高,如 Ser199/202,Thr205,Ser262 和 Ser396,而总 tau 蛋白（Tau-5）表达量没有明显变化。经鼻吸入胰岛素能够显著降低上述位点的磷酸化水平。Tau蛋白的磷酸化与其激酶和磷酸酶的活性有关。为了阐明胰岛素降低tau过度磷酸化的机制,我们检测了相关的激酶和磷酸酶的表达水平。我们发现各组大鼠脑内tau蛋白激酶总量无明显差异。在ICV-STZ大鼠脑内,糖原合成酶-3（glycogen synthase kinase-3,GSK-3）、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase,MAPK/ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase,JNK）、和钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependentproteinkinaseⅡ,CaMKⅡ）的磷酸化水平明显升高。吸入胰岛素能够将GSK-3、ERK1/2和CaMKⅡ的磷酸化水平降低到正常组水平。蛋白磷酸酶2（PP2A）是人脑内最重要的tau的磷酸酶。我们没有观察到ICV-STZ大鼠脑内PP2A-C蛋白水平和其活性的改变,胰岛素治疗对其也没有影响。这些结果表明,经鼻吸入胰岛素降低ICV-STZ大鼠脑内过度磷酸化的tau可能是通过下调ERK1/2和CaMKⅡ的活性实现的。4.为了研究胰岛素对神经炎症的影响,我们检测了三组大鼠脑内胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和离子钙接头分子-1（ionized Ca2+-binding adaptor molecule-1,Iba1）的表达水平。结果显示,与对照组相比,ICV-STZ大鼠脑内GFAP和Iba1水平显著增高,而胰岛素能够明显抑制Iba1的表达。免疫组化的结果进一步印证了以上结果。5.我们还检测了三组大鼠海马新生神经元标记物doublecortin（DCX）和突触前膜、突触后膜相关蛋白水平的变化。结果显示与对照组相比,ICV-STZ大鼠脑内的DCX、突触素（synaptophysin）、突触蛋白1（synapsin 1）和突触后密度蛋白-95（PSD-95）表达水平无明显差别。但是胰岛素组的DCX水平确明显高于对照组,此外,胰岛素组的synapsin 1水平高于生理盐水组。6.为了研究经鼻吸入胰岛素对脑胰岛素信号通路的影响,我们检测了通路上相关蛋白的表达水平和活性。我们发现ICV-STZ大鼠脑内IRS1和AKTpT308水平明显升高,说明ICV-STZ大鼠脑内存在一定的胰岛素信号通路异常。吸入胰岛素使ICV-STZ大鼠海马内升高的AKTpT308水平恢复到正常水平。7.脑葡萄糖代谢降低是AD的一个重要的病理生理特征。为了评估经鼻吸入胰岛素是否会影响ICV-STZ大鼠的脑葡萄糖代谢,我们应用microPET检测了大鼠脑内18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)的标准化摄取值（SUVs）。结果显示,与对照组相比,注射侧ICV-STZ大鼠前额叶皮层、扣带回、纹状体、海马和内嗅皮层18F-FDG SUVs明显降低。经鼻吸入胰岛素能够明显增加ICV-STZ大鼠前额叶皮层和扣带回的18F-FDG SUVs。为了研究胰岛素对各脑区神经元的影响,接下来我们用免疫组化方法检测了神经元标记物—NeuN在各脑区的表达。结果显示ICV-STZ大鼠海马的CA1、CA3区和纹状体的阳性细胞数较对照组显著减少。经鼻吸入胰岛素增加了 ICV-STZ大鼠海马的CA1、CA3区的NeuN阳性细胞数,提示胰岛素可以阻止ICV-STZ大鼠海马内的神经元丢失。结论本研究发现ICV-STZ大鼠存在认知功能障碍,tau过度磷酸化,神经炎症。此外,我们还发现注射侧ICV-STZ大鼠前额叶皮层、扣带回、纹状体、海马和内嗅皮层葡萄糖代谢显著降低。经鼻吸入胰岛素6周可以明显改善ICV-STZ大鼠的认知功能,减轻脑内tau蛋白的过度磷酸化和小胶质细胞激活,增加海马内新生神经元生成;吸入胰岛素还显著改善了 ICV-STZ大鼠前额叶皮层和扣带回的葡萄糖代谢,防止海马神经元丢失。