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基因治疗能从根本上阻止许多脑部退行性疾病的病理进展,是极具潜力的治疗手段。但由于基因本身以及病毒和非病毒载体无法自主跨越血脑屏障(BBB)到达脑实质,致使目前脑部基因导入的主要方法是直接开颅于脑实质定位注射,该方法伤害大且难以实施多次给药,不利于临床应用。已有研究报道采用特异性修饰的非病毒载体经血管途径给药,可实现外源基因在脑部的表达,但普遍存在转染和表达效率较低的缺点。因此,探索具有脑靶向性且高效表达的非病毒基因载体,实现经血管途径给药达到脑部外源性基因的广泛表达,对于脑部退行性疾病的治疗具有至关重要的意义。本课题通过药剂学、高分子学和生物学等技术手段的交叉应用,构建了一种新型高效的脑靶向非病毒纳米基因递释系统。该系统以阳离子聚合物聚甲基丙烯酸酯(PDMAEMA)为基础载体材料,通过亲水性高分子聚乙二醇(PEG)与新型脑靶向功能基TGN(采用噬菌体展示技术筛选得到对脑有高亲和力的十二肽)相连,合成TGN-PEG-PDMAEMA载体高分子,进而将载体与基因通过静电作用自组装形成载基因药物的TGN-PEG-PDMAEMA纳米粒。该纳米粒具有以下特点：①所采用的阳离子载体材料PDMAEMA易于合成,载基因能力强,转染效率高；②聚乙二醇包裹在纳米粒表面,延长纳米粒的体内滞留时间,减少阳离子聚合物因强烈的正电性引发的的毒性；③将TGN修饰在纳米粒表面,增强纳米粒的脑靶向性。本文研究内容主要包括三个部分：(1)TGN肽修饰的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸酯纳米粒的构建及脑内递药研究；(2)TGN肽修饰的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸酯共聚物作为NGF基因递释载体研究；(3)TGN肽修饰聚乙二醇-聚甲基丙烯酸酯作为脑靶向基因载体的初步机理研究。本文第一部分,通过原子转移自由基聚合法合成了MPEG-PDMAEMA和Mal-PEG-PDMAEMA嵌段共聚物,核磁共振图谱和凝胶渗透色谱验证结构正确。利用Mal-PEG-PDMAEMA末端暴露的马来酰亚胺基与含巯基的TGN(TGNYKALHPHNGC)共价结合,成功制备了TGN-PEG-PDMAEMA。通过阳离子材料与阴离子DNA之间的静电相互作用,制备了不同氮磷比(N/P)的纳米粒,琼脂糖凝胶电泳和DNA含量测定(PicoGreen分析)结果显示,TGN的修饰使阳离子材料对DNA的压缩作用稍有减弱,但在N/P>1.25时,阳离子材料即可以完全压缩DNA。以粒径、zeta电位、细胞毒性和体外转染效率为指标,确定了制备纳米粒的最佳N/P值为10。 该条件下制备的TGN-PEG-PDMAEMA/DNA纳米粒,其包封率>99.9%；粒径在78.6 nm左右,zeta电位在4.82 mV左右,形态圆整、大小均匀；细胞毒性明显低于PEI 25 kD所制纳米粒(N/P=10)。TGN-PEG-PDMAEMA/DNA纳米粒具有一定抵抗外界阴离子物质和血清置换的能力,能够保护所载DNA免受DNase Ⅰ的降解并保持DNA的完整性。为了评价TGN修饰后载基因纳米粒的脑内递药特性,采用编码绿色荧光蛋白和编码虫荧光素酶的两种报告基因,分别从定性和定量对TGN修饰后载基因纳米粒的脑靶向性进行评价。载报告基因纳米粒体外转染脑毛细血管内皮细胞(bEnd.3)后,定性观察发现,TGN修饰的纳米粒组表达绿色荧光蛋白的阳性细胞数明显多于未修饰纳米粒组；定量结果显示,TGN修饰的纳米粒介导基因转染的效率是未修饰纳米粒的2.96倍(p<0.01)。细胞摄取也显示出类似的结果。利用核酸染料EMA将DNA染色,考察纳米粒的体内分布。小动物活体成像显示,TGN的修饰可显著增加纳米粒在脑部的分布,减少在肝和肾等代谢脏器的蓄积。小鼠尾静脉注射载基因纳米粒48 h后,脑组织冰冻切片后定性观察发现,经TGN修饰的纳米粒能够增加基因在第三脑室、侧脑室、内侧前庭核、下丘脑、皮质层、海马、黑质和尾状壳核等脑区域绿色荧光蛋白的表达,定量测定结果显示,经TGN修饰的纳米粒组在脑部的表达水平是未修饰组的3倍(p<0.01)。第二部分选用对阿尔茨海默症有良好治疗作用的神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)基因作为模型药物,评价了载NGF基因纳米粒在AD模型小鼠上的药效。制备载NGF基因的TGN-PEG-PDMAEMA纳米粒,其粒径在80nm左右,zeta电位约为5 mV。研究发现,三次静脉给药(隔天给药1次)后基因产物的表达量是单次给药的1.76倍,由此确定了药效学研究的给药方式。采用双侧海马定位注射Aβ1-40聚集肽构建小鼠AD模型,通过Morris水迷宫实验评价了载NGF基因纳米粒对于小鼠学习能力及空间记忆障碍的改善作用。通过测定小鼠皮层和海马中乙酰胆碱酯酶(TChE)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)的活力以及观察海马区的病理切片来评价载NGF基因纳米粒对于中枢胆碱能神经元的保护作用。结果显示,TGN肽修饰的载报告基因EGFP纳米粒静脉注射后对于Aβ140聚集肽所致的AD模型小鼠无改善作用。未修饰TGN肽的载NGF基因纳米粒静脉注射后(20μg DNA/鼠／次)对AD模型小鼠无明显改善作用,即使给药剂量提高至50 μg DNA/鼠／次,对于记忆能力及生化指标的改善作用仍不够理想。TGN肽修饰纳米粒在低给药剂量(10 μg DNA/鼠／次)时已经能够产生明显的空间记忆改善作用,将剂量提高到20 μg DNA/鼠／次时,能显著降低小鼠脑内皮层与海马区的TChE含量,提高ChAT含量,且能够减轻Ap斑块在海马区的沉积,减少海马区神经细胞的凋亡,有效缓解AD的病理特征。小鼠尾静脉注射载基因纳米粒5次(隔天1次,共11天),脑、心、肝、脾、肺和肾等脏器均未发现明显的组织病理学改变,初步安全性结果显示该基因递释系统体内安全性良好。论文第三部分对TGN肽修饰聚乙二醇-聚甲基丙烯酸酯作为脑靶向基因载体的机理进行初步研究。首先以核酸染料YOYO-1将DNA染色,bEnd.3细胞摄取荧光标记的载基因纳米粒的定性定量结果显示,TGN-PEG-PDMAEMA/DNA纳米粒的细胞摄取量随孵育时间、纳米粒浓度的增加而增加,温度显著影响TGN-PEG-PDMAEMA/DNA纳米粒的摄取,表明在细胞摄取的过程中存在递药系统的内化,依赖能量的供给。胞吞抑制实验显示,TGN-PEG-PDMAEMA/DNA纳米粒在bEnd.3细胞的摄取是网格蛋白介导、陷穴小泡介导和巨胞饮方式混合作用的结果,该胞吞过程依赖能量,TGN在该过程中起着至关重要的作用,但与转铁蛋白受体无关。共聚焦显微镜观察证实：TGN-PEG-PDMAEMA/DNA纳米粒被bEnd.3细胞胞吞后转运进溶酶体,但纳米粒能快速从溶酶体逃逸,并递送基因入核。纳米粒在小鼠脑分布的结果显示,TGN修饰的纳米粒在小鼠海马、皮质层、黑质和尾状壳核有广泛分布,纳米粒的入脑量会被大剂量的(2 mg)游离TGN肽抑制,表明TGN肽在介导纳米粒跨BBB上起重要作用。对小鼠脑部转染的绿色荧光蛋白进行定位,发现纳米粒介导大部分DNA跨越BBB后表达于脑实质,少部分在BBB上表达。进一步通过体外PC12神经细胞摄取实验表明,TGN-PEG-PDMAEMA/DNA纳米粒跨越BBB之后不会靶向到神经细胞,而是散在分布于脑实质。