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胃癌是一种来源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是全球最常见的恶性肿瘤之一，近年来随着检验检查技术的提高和全球人口的老龄化，其总体的发病数和死亡数仍居高不下，并且有研究显示全球有接近半数的胃癌患者发生于东亚地区，其中我国占很大比例。目前大家普遍认为，癌基因的激活和/或抑癌基因的失活是恶性肿瘤发生、发展的重要机制。因此寻找新的癌或抑癌基因，不仅能为研究胃癌的发生发展提供理论基础，也为胃癌的早期诊断、判断预后及靶向治疗提供新的标志物。
Krüppel样转录因子(krüppellikefactors，KLF)是一类存在于哺乳动物真核细胞中并在其内广泛表达的锌指蛋白样转录因子，氨基端(N端)序列作为转录调控活性区域，与C端高度保守不同，表现出很强的多样性，这就使得KLF家族可以招募不同的共抑制因子或者共激活因子，并且根据结合位点的不同发挥不同的转录调节作用，现发现KLF家族共由17个成员(KLF1- KLF17)组成。近年来研究显示，KLF11与肿瘤发生发展有着密切的联系，并且在细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学行为中发挥着重要的作用。既往研究发现KLF11在胰腺癌、肝细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、骨髓增生异常综合征等恶性疾病中表达异常，但其在胃癌中的表达水平及其作用机制尚不明确，需要进一步的研究和探索。
本研究是以人胃癌组织、永生化的正常胃黏膜细胞株(GES-1细胞株)及不同分化的人胃癌细胞株为研究对象，分别应用免疫组织化学、RNA及蛋白提取技术、实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、蛋白印迹法(Western Blot)、细胞转染技术、细胞划痕实验、Transwell小室、荧光素酶报告基因检测等实验方法，首先研究了胃癌及癌旁组织中KLF11mRNA和蛋白的表达差异，并且分析了KLF11基因的这种差异性表达与胃癌患者临床生物学特性和病理数据之间的联系；然后通过小RNA干扰技术来抑制KLF11表达后，观察其对胃癌细胞株BGC823和HGC27的侵袭和迁移的影响，并对相关蛋白进行了分析，最后在BGC823细胞株中应用荧光素酶报告基因检测技术研究了KLF11影响胃癌细胞株侵袭迁移能力的潜在机制，从而为更进一步的认识和研究胃癌发生发展及其分子机制提供了基础和新的方向。
第一部分胃癌中转录因子KLF11的表达及其与临床生物学特性关系的研究
目的：
验证KLF11在胃癌组织、癌旁组织、GES-1细胞及各胃癌细胞株中的表达，以及与胃癌患者各项临床特征和病理学参数之间的关系。
方法：
1.应用RT-qPCR、WesternBlot和免疫组织化学技术检测59对胃癌组织和癌旁正常胃组织中KLF11mRNA和蛋白的表达水平。
2.分析KLF11表达水平与胃癌患者各项临床病理学参数之间的关系。
3.应用RT-qPCR和WesternBlot技术检测6株不同分化程度的胃癌细胞和GES-1细胞中KLF11mRNA和蛋白的表达水平。
结果：
1.免疫组织化学、RT-qPCR和WesternBlot结果显示：KLF11在胃癌组织中的表达水平要显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.KLF11表达上调与胃癌患者的性别、年龄、分化程度、远处转移无关，而与肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移及TNM分期显著相关(P＜0.05)。
3.与GES-1细胞株相比，HGC27、BGC823、MKN45、SGC7901、MGC803、MKN74胃癌细胞株中KLF11表达均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，且以未分化胃癌细胞HGC27和低分化胃癌细胞BGC823升高最明显。
小结：
1.KLF11可能是胃癌发生及进展的因素之一，有原癌基因特征。
2.KLF11表达水平的升高与胃癌患者的肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移及TNM分期显著相关，其可能成为潜在的胃癌肿瘤标志物之一。
3.胃癌细胞株中KLF11mRNA和蛋白表达高于胃上皮细胞株，可以高表达KLF11的细胞株进行后续的功能实验及分析。
第二部分转录因子KLF11对胃癌细胞株HGC27和BGC823侵袭及迁移能力的影响
目的：
研究有效抑制KLF11后对胃癌细胞株HGC27和BGC823侵袭及迁移能力的影响。
方法：
1.构建能有效抑制KLF11的小干扰RNA，并且转染至HGC27和BGC823胃癌细胞株。
2.应用细胞划痕和Transwell实验研究抑制KLF11后对HGC27和BGC823细胞迁移和侵袭的影响，并应用RT-qPCR及WesternBlot检测抑制KLF11后对侵袭和迁移相关蛋白表达的影响。
3.运用RT-qPCR和WesternBlot技术检测抑制KLF11后对HGC27和BGC823细胞株的上皮间质转化(EMT)相关蛋白的影响。
结果：
1.RT-qPCR结果显示与NC(Negative control)及CON(Blank control)组细胞相比，转染组细胞的KLF11mRNA表达水平明显降低，以siRNA2在60nM浓度下效果最为明显。CON与NC组之间差异无统计学意义。WesternBlot结果显示：转染组细胞的KLF11蛋白表达水平较NC及CON组明显降低，同样是以siRNA2在60nM浓度下效果最为明显(P＜0.05)，NC及CON组间无差异。
2.细胞划痕实验结果显示与NC及CON组相比，KLF11转染组细胞的平面迁移活性受到明显抑制(P＜0.05)，NC及CON组间无差异。
3.Transwell细胞侵袭实验结果显示抑制KLF11后HGC27及BGC823细胞通过Transwell小室基质胶的细胞数明显少于NC及CON组(P＜0.05)，NC及CON组间无差异。
4.RT-qPCR及WesternBlot结果显示，在抑制KLF11后转染组MMP2、MMP9及ICAM1表达水平较NC及CON组明显降低(P＜0.05)，而转染组TIMP1、TIMP2表达水平较NC及CON组无明显变化，NC及CON组间无差异。
5.RT-qPCR及WesternBlot结果显示，抑制KLF11后转染组和NC及CON组相比E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达水平明显升高，而N-钙粘蛋白(N-cadherin)及Vimentin的表达水平均明显降低(P＜0.05)，β-catenin表达水平没有明显变化，NC及CON组间无差异。
小结：
1.成功构建出能有效抑制KLF11的HGC27及BGC823胃癌细胞株。
2.抑制KLF11可明显抑制HGC27及BGC823胃癌细胞的迁移和侵袭能力，可能与下调MMP-2、MMP-9及ICAM1水平有关。
3.抑制KLF11后HGC27及BGC823细胞内E-cadherin表达水平明显升高、N-cadherin及Vimentin蛋白的表达水平均明显降低，因此KLF11可能参与了HGC27及BGC823细胞EMT的发生。
第三部分调节转录因子KLF11对胃癌细胞株EMT相关机制的研究
目的：
研究调节KLF11表达后对胃癌细胞EMT影响的相关机制。
方法：
1.构建能有效抑制KLF11的HGC27和BGC823胃癌细胞株,及过表达KLF11的BGC823胃癌细胞株。
2.应用RT-qPCR及WesternBlot技术检测抑制KLF11后EMT相关通路蛋白Snail1,Snail2和Twist1的表达变化情况。
3.在过表达KLF11的BGC823细胞株中，应用荧光素酶报告基因技术检测EMT相关转录因子与KLF11之间的关系。
结果：
1.RT-qPCR结果显示与NC及CON组相比，KLF11转染组细胞内的Twist1表达水平明显降低(P＜0.05)，而Snail1和Snail2表达水平没有明显变化。WesternBlot结果显示KLF11转染组细胞内的Twist1蛋白表达水平较NC及CON组显著降低，Snail1和Snail2表达无变化。NC及CON组间无差异。
2.RT-qPCR及WesternBlot结果显示，在一定范围内随着转染KLF11质粒量的增加，Twist1的表达水平也显著增加(P＜0.05)。且荧光素酶报告基因技术检测显示在一定范围内随着转染KLF11质粒量的增加，Twist1的启动序列的活性也显著增强(P＜0.05)。
小结：
1.成功构建能有效抑制KLF11的HGC27和BGC823胃癌细胞株,及过表达KLF11的BGC823胃癌细胞株。
2.在HGC27和BGC823细胞中，抑制KLF11表达后，Twist1的表达水平也显著降低，说明KLF11可能通过调节Twist1的表达来调控其EMT的过程。
3.在BGC823细胞中，KLF11作为Twist1的上游激活因子，通过直接激活Twist1启动子的表达来介导EMT的发生发展过程。
结论
1.KLF11在胃癌组织中的表达水平明显上调，并且与患者肿瘤大小、浸润程度、局部淋巴结转移及TNM分期明确相关；在HGC27、BGC823、MKN45、SGC7901、MGC803及MKN74胃癌细胞株中KLF11表达均升高，且以HGC27及BGC823细胞升高最明显。
2.抑制KLF11后能在体外显著抑制HGC27及BGC823胃癌细胞株的迁移和侵袭能力，可能与下调MMP-2、MMP-9及ICAM1水平有关。
3.在HGC27及BGC823胃癌细胞株中，KLF11介导的的胃癌细胞株EMT发生发展可能是通过调节E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白的表达来实现。
4.在BGC823胃癌细胞株中，KLF11可直接作用于Twist1的启动序列，调节Twist1的表达，进而促进胃癌细胞株的EMT的发生发展过程。
Krüppel样转录因子(krüppellikefactors，KLF)是一类存在于哺乳动物真核细胞中并在其内广泛表达的锌指蛋白样转录因子，氨基端(N端)序列作为转录调控活性区域，与C端高度保守不同，表现出很强的多样性，这就使得KLF家族可以招募不同的共抑制因子或者共激活因子，并且根据结合位点的不同发挥不同的转录调节作用，现发现KLF家族共由17个成员(KLF1- KLF17)组成。近年来研究显示，KLF11与肿瘤发生发展有着密切的联系，并且在细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学行为中发挥着重要的作用。既往研究发现KLF11在胰腺癌、肝细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、骨髓增生异常综合征等恶性疾病中表达异常，但其在胃癌中的表达水平及其作用机制尚不明确，需要进一步的研究和探索。
本研究是以人胃癌组织、永生化的正常胃黏膜细胞株(GES-1细胞株)及不同分化的人胃癌细胞株为研究对象，分别应用免疫组织化学、RNA及蛋白提取技术、实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、蛋白印迹法(Western Blot)、细胞转染技术、细胞划痕实验、Transwell小室、荧光素酶报告基因检测等实验方法，首先研究了胃癌及癌旁组织中KLF11mRNA和蛋白的表达差异，并且分析了KLF11基因的这种差异性表达与胃癌患者临床生物学特性和病理数据之间的联系；然后通过小RNA干扰技术来抑制KLF11表达后，观察其对胃癌细胞株BGC823和HGC27的侵袭和迁移的影响，并对相关蛋白进行了分析，最后在BGC823细胞株中应用荧光素酶报告基因检测技术研究了KLF11影响胃癌细胞株侵袭迁移能力的潜在机制，从而为更进一步的认识和研究胃癌发生发展及其分子机制提供了基础和新的方向。
第一部分胃癌中转录因子KLF11的表达及其与临床生物学特性关系的研究
目的：
验证KLF11在胃癌组织、癌旁组织、GES-1细胞及各胃癌细胞株中的表达，以及与胃癌患者各项临床特征和病理学参数之间的关系。
方法：
1.应用RT-qPCR、WesternBlot和免疫组织化学技术检测59对胃癌组织和癌旁正常胃组织中KLF11mRNA和蛋白的表达水平。
2.分析KLF11表达水平与胃癌患者各项临床病理学参数之间的关系。
3.应用RT-qPCR和WesternBlot技术检测6株不同分化程度的胃癌细胞和GES-1细胞中KLF11mRNA和蛋白的表达水平。
结果：
1.免疫组织化学、RT-qPCR和WesternBlot结果显示：KLF11在胃癌组织中的表达水平要显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.KLF11表达上调与胃癌患者的性别、年龄、分化程度、远处转移无关，而与肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移及TNM分期显著相关(P＜0.05)。
3.与GES-1细胞株相比，HGC27、BGC823、MKN45、SGC7901、MGC803、MKN74胃癌细胞株中KLF11表达均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，且以未分化胃癌细胞HGC27和低分化胃癌细胞BGC823升高最明显。
小结：
1.KLF11可能是胃癌发生及进展的因素之一，有原癌基因特征。
2.KLF11表达水平的升高与胃癌患者的肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移及TNM分期显著相关，其可能成为潜在的胃癌肿瘤标志物之一。
3.胃癌细胞株中KLF11mRNA和蛋白表达高于胃上皮细胞株，可以高表达KLF11的细胞株进行后续的功能实验及分析。
第二部分转录因子KLF11对胃癌细胞株HGC27和BGC823侵袭及迁移能力的影响
目的：
研究有效抑制KLF11后对胃癌细胞株HGC27和BGC823侵袭及迁移能力的影响。
方法：
1.构建能有效抑制KLF11的小干扰RNA，并且转染至HGC27和BGC823胃癌细胞株。
2.应用细胞划痕和Transwell实验研究抑制KLF11后对HGC27和BGC823细胞迁移和侵袭的影响，并应用RT-qPCR及WesternBlot检测抑制KLF11后对侵袭和迁移相关蛋白表达的影响。
3.运用RT-qPCR和WesternBlot技术检测抑制KLF11后对HGC27和BGC823细胞株的上皮间质转化(EMT)相关蛋白的影响。
结果：
1.RT-qPCR结果显示与NC(Negative control)及CON(Blank control)组细胞相比，转染组细胞的KLF11mRNA表达水平明显降低，以siRNA2在60nM浓度下效果最为明显。CON与NC组之间差异无统计学意义。WesternBlot结果显示：转染组细胞的KLF11蛋白表达水平较NC及CON组明显降低，同样是以siRNA2在60nM浓度下效果最为明显(P＜0.05)，NC及CON组间无差异。
2.细胞划痕实验结果显示与NC及CON组相比，KLF11转染组细胞的平面迁移活性受到明显抑制(P＜0.05)，NC及CON组间无差异。
3.Transwell细胞侵袭实验结果显示抑制KLF11后HGC27及BGC823细胞通过Transwell小室基质胶的细胞数明显少于NC及CON组(P＜0.05)，NC及CON组间无差异。
4.RT-qPCR及WesternBlot结果显示，在抑制KLF11后转染组MMP2、MMP9及ICAM1表达水平较NC及CON组明显降低(P＜0.05)，而转染组TIMP1、TIMP2表达水平较NC及CON组无明显变化，NC及CON组间无差异。
5.RT-qPCR及WesternBlot结果显示，抑制KLF11后转染组和NC及CON组相比E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达水平明显升高，而N-钙粘蛋白(N-cadherin)及Vimentin的表达水平均明显降低(P＜0.05)，β-catenin表达水平没有明显变化，NC及CON组间无差异。
小结：
1.成功构建出能有效抑制KLF11的HGC27及BGC823胃癌细胞株。
2.抑制KLF11可明显抑制HGC27及BGC823胃癌细胞的迁移和侵袭能力，可能与下调MMP-2、MMP-9及ICAM1水平有关。
3.抑制KLF11后HGC27及BGC823细胞内E-cadherin表达水平明显升高、N-cadherin及Vimentin蛋白的表达水平均明显降低，因此KLF11可能参与了HGC27及BGC823细胞EMT的发生。
第三部分调节转录因子KLF11对胃癌细胞株EMT相关机制的研究
目的：
研究调节KLF11表达后对胃癌细胞EMT影响的相关机制。
方法：
1.构建能有效抑制KLF11的HGC27和BGC823胃癌细胞株,及过表达KLF11的BGC823胃癌细胞株。
2.应用RT-qPCR及WesternBlot技术检测抑制KLF11后EMT相关通路蛋白Snail1,Snail2和Twist1的表达变化情况。
3.在过表达KLF11的BGC823细胞株中，应用荧光素酶报告基因技术检测EMT相关转录因子与KLF11之间的关系。
结果：
1.RT-qPCR结果显示与NC及CON组相比，KLF11转染组细胞内的Twist1表达水平明显降低(P＜0.05)，而Snail1和Snail2表达水平没有明显变化。WesternBlot结果显示KLF11转染组细胞内的Twist1蛋白表达水平较NC及CON组显著降低，Snail1和Snail2表达无变化。NC及CON组间无差异。
2.RT-qPCR及WesternBlot结果显示，在一定范围内随着转染KLF11质粒量的增加，Twist1的表达水平也显著增加(P＜0.05)。且荧光素酶报告基因技术检测显示在一定范围内随着转染KLF11质粒量的增加，Twist1的启动序列的活性也显著增强(P＜0.05)。
小结：
1.成功构建能有效抑制KLF11的HGC27和BGC823胃癌细胞株,及过表达KLF11的BGC823胃癌细胞株。
2.在HGC27和BGC823细胞中，抑制KLF11表达后，Twist1的表达水平也显著降低，说明KLF11可能通过调节Twist1的表达来调控其EMT的过程。
3.在BGC823细胞中，KLF11作为Twist1的上游激活因子，通过直接激活Twist1启动子的表达来介导EMT的发生发展过程。
结论
1.KLF11在胃癌组织中的表达水平明显上调，并且与患者肿瘤大小、浸润程度、局部淋巴结转移及TNM分期明确相关；在HGC27、BGC823、MKN45、SGC7901、MGC803及MKN74胃癌细胞株中KLF11表达均升高，且以HGC27及BGC823细胞升高最明显。
2.抑制KLF11后能在体外显著抑制HGC27及BGC823胃癌细胞株的迁移和侵袭能力，可能与下调MMP-2、MMP-9及ICAM1水平有关。
3.在HGC27及BGC823胃癌细胞株中，KLF11介导的的胃癌细胞株EMT发生发展可能是通过调节E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白的表达来实现。
4.在BGC823胃癌细胞株中，KLF11可直接作用于Twist1的启动序列，调节Twist1的表达，进而促进胃癌细胞株的EMT的发生发展过程。