论文部分内容阅读
随着人们生活水平的提高，冠心病已成为威胁人类生命和健康的最主要杀手之一，其中急性心肌梗死是心衰和死亡的主要原因，尽早给予急性心肌梗死患者再灌注治疗是挽救濒死心肌、恢复心脏功能积极有效的方法。但是再灌注治疗过程同时存在再灌注损伤，后者减弱了再灌注给机体带来的益处，因此，如何才能减轻再灌注损伤自然成了研究的重点内容。近年来大量的研究表明，过度的炎症反应是心肌缺血再灌注损伤的主要机制之一，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等促炎细胞因子明显表达并占主导地位。随着PCI技术的普及和发展，越来越多的心肌梗死病人能够接受直接PCI，梗死心肌得到及时的再灌注，但在这一治疗过程中，常常强调抗血小板、抗凝药物的应用的必要性，却往往忽略抑制炎性细胞因子及其他减轻再灌注损伤药物的应用。有研究表明，1型多聚ADP-核糖聚合酶(PARP-1)活化对细胞因子的产生途径起重要的调节作用。本研究应用大鼠心肌缺血再灌注模型，观察心肌缺血再灌注早期心肌组织及血清中细胞因子IL-6、TNF-a及IL-10的动态变化及相关性，同时应用PARP-1抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)，观察其对IL-6、TNF-a、IL-10表达及心肌梗死面积的影响，探讨其作用机制。
材料与方法
一、实验材料
1、实验动物
雄性Wistar大鼠260-300 g，由中国医科大学动物实验中心提供。分笼饲养于恒温(20(±)2℃)、恒湿(50-60％)、无特殊病原体条件下，饮用水和标准饲料均经灭菌后供动物自由取用。
2、主要试剂
ELASA试剂盒（美国R&D公司）;3-氨基苯甲酰胺（美国Sigma公司）;氯化三苯四氮唑（美国Sigma公司）;伊文氏兰（瑞士Fluka公司）
3、实验仪器
心电图机（上海光电仪器有限公司），动物人工呼吸机（上海嘉鹏科技有限公），高速冰冻离心机(Sigma，Germany)，光学显微镜(OLYMPUS，Japan)，石蜡切片机RM-2145（德国Leica公司），低温冰箱（SANYO，Japan），ELX-800型酶标仪(Bio-tek，USA)。
二、实验方法
（一）动物分组及模型制作
1、动物分组
将134只大鼠随机分为:
(1)缺血再灌注组:
缺血再灌注15min组（I/R15min组，n=8）;
缺血再灌注30min组（I/R30min组，n=8）;
缺血再灌注1h组（I/R1h组，n=8）;
缺血再灌注2h组（I/R2h组，n=8）;
缺血再灌注4h组（I/R4h组，n=8）;
缺血再灌注6h组（I/R6h组，n=8）;
缺血再灌注24h组（I/R24h组，n=8）;
(2)假手术组:
假手术15min组（sham15min组，n=6）;
假手术30min组（sham30min组，n=6）;
假手术1h组（sham1h组，n=6）;
假手术2h组（sham2h组，n=6）;
假手术4h组（sham4h组，n=6）;
假手术6h组（sham6h组，n=6）;
假手术24h组（sham24h组，n=6）;
(3)缺血再灌注2h+3AB组（I/R2h+3AB组，n=12）:①检测心肌梗死面积，n=6;②检测心肌组织及血清中各指标，n=6;
(4)缺血再灌注2h+生理盐水组（I/R2h+生理盐水组，n=12）:①检测心肌梗死面积，n=6;②检测心肌组织及血清中各指标，n=6;
(5)假手术+3AB组（sham+3AB组，n=6）;
(6)假手术+生理盐水组（sham+生理盐水组，n=6）;
2、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型制备
大鼠用10％水合氯醛0.4mL/100g腹腔注射麻醉，取仰卧位固定，气管切开插管行小动物呼吸机辅助呼吸，潮气量10 mL/kg，吸呼比1∶1.5，呼吸频率75次/min。在第四肋间行左胸廓切开术，打开心包，挤出大部分心脏。暴露左心耳，以5/0线在距冠状动脉前降支根部1-2mm形成一个直径约5mm的活结，将长度约5mm的PE-10聚乙烯软管置于活结中，结扎后，见左室游离壁立即变白（或发绀）及心电图ST段抬高或QRS波宽高畸形并持续存在为结扎成功。45min后拔出聚乙烯软管，使冠状动脉血流再通，再灌注时局部组织充血及心电图ST段回落或QRS变窄。假手术组在相同部位穿线但不结扎。缺血再灌注2h+3AB组:建立(I/R)模型，分别于再灌注前15min及其后1小时给予3-AB(20mg/kg，iv)。缺血再灌注2h+生理盐水组:建立(I/R)模型，分别于再灌注前15min及其后1h给予等体积生理盐水静注。假手术+3AB组:建立假手术模型，分别于与手术药物干预组相同时间点（开胸后30分钟其后1小时）给予3-AB(20mg/kg，iv)。假手术+生理盐水组:建立假手术模型，分别于与手术药物干预组相同时间点（开胸后30分钟其后1小时）给予等体积生理盐水静注。
（二）检测方法
1、多媒体彩色病理图像分析系统测量心肌梗死范围（infarction size）。
2、酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清细胞因子IL-6、IL-10、TNF-a的表达。
3、心肌组织匀浆细胞因子IL-6、IL-10、TNF-a检测用ELISA法，操作过程同血清内细胞因子检测，同时用考马斯亮蓝蛋白测定法检测每个组织标本的蛋白含量，得出数值后，将每毫升匀浆液中的细胞因子含量换算成每毫克蛋白中的细胞因子含量。
实验结果
1、 I/R各组(I/R15min、I/R30 min、I/R1h、I/R2h、I/R4hI/R、I/R6h、I/R24h)心肌组织中TNF-a含量(pg/mg)、IL-6的含量(pg/mg)、IL-10含量(pg/mg)和血清中TNF-a含量(ng/ml)、IL-6的含量(pg/ml)、IL-10含量(pg/ml)均明显表达，与对应时间点的sham组(sham15min、sham30 min、sham1h、sham2h、sham4h、sham6h、sham24h)比较有显著差异(P＜0.05)。
2、I/R2h+3AB组心肌中TNF-a含量(pg/mg)、IL-6含量(pg/mg)、IL-10含量（pg/mg）和血清中TNF-a含量(ng/ml)、IL-6的含量(pg/ml)、IL-10含量（pg/ml）与I/R2h+生理盐水组比较有显著差异(P＜0.01)，与sham+3AB组比较有显著差异(P＜0.01)。
3、缺血再灌注早期心肌组织中细胞因子IL-6、IL-10、TNF-a的含量与血清中IL-6、IL-10、TNF-a的含量具有正相关性(P＜0.01)。
4、I/R2h+3AB组心肌梗死面积(infarct size，IS)（20.02±2.23）％与I/R2h+生理盐水组（33.24±3.79）％比较有显著差异(P＜0.05)。
结论：
1、心肌缺血再灌注早期心肌组织及血清中细胞因子白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、白介素10(IL-10)均明显表达，再灌注15分钟至2小时各指标均逐渐升高，4小时至6小时逐渐下降，24小时又略有升高，呈峰值为再灌注2-4小时的动态变化。
2、缺血再灌注早期心肌组织中细胞因子IL-6、IL-10、TNF-a的含量与血清中IL-6、IL-10、TNF-a的含量具有正相关性。
3、3-AB对心肌缺血再灌注早期的保护作用的途径之一是通过抑制白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-a)等促炎细胞因子的表达实现，而不是通过升高保护性细胞因子IL-10实现。
4、3-AB对细胞因子IL-6、TNF-a有明显抑制作用，能减轻心肌再灌注心肌损伤，减小心肌梗死面积。心肌缺血再灌注早期，积极有效的应用IL-6、TNF-a等细胞因子抑制剂具有重要意义和临床价值。