病毒在自然界中广泛存在,可以感染动物、植物、细菌、真菌等。病毒感染不仅会给人们带来巨大的经济损失,甚至严重危害人类的身体健康及生命安全,尤其是感染人和动物的病毒。登革热病毒（DENV）属于黄病毒科黄病毒属的单股正链RNA病毒,通过蚊虫叮咬感染人体后会导致登革热、登革出血热、登革休克综合征等,致死率极高,且发病率一直居高不下。随着埃及伊蚊分布的地理范围的扩大,近几十年来其发生率增加了30倍之多,是目前世界上最危险的热带病毒之一。寨卡病毒（ZIKV）与DENV一样属于黄病毒科黄病毒属的正链RNA病毒,也是一种虫媒传播的病毒。ZIKV感染母体后可以导致胎儿先天性畸形,包括小头畸形、颅面畸形、痉挛、眼畸形和流产。ZIKV感染成人后会导致自身免疫性疾病格林-巴列综合征,这种免疫性疾病会使免疫系统攻击周围神经,从而导致肌无力和重症瘫痪。近几年来,美洲等多地区暴发寨卡疫情。丙型肝炎病毒（HCV）病毒属于黄病毒科肝炎病毒属,有7种基因型和67种基因亚型,基因组与DENV相似,为正链RNA病毒,大小为9.6 kb。自然条件下,HCV只能感染人类和黑猩猩。HCV病毒如果发生持续感染会导致慢性肝炎及其他危及生命的并发症,包括肝功能衰竭和肝细胞癌。全世界大概有1.7亿人感染了HCV,而目前却没有有效的疫苗来预防HCV的感染。虽然临床上有直接杀病毒药物（DAAs）可以用来治疗HCV感染的病人,但由于其价格昂贵且易于产生耐药性,因此需要开发新的药物。对于DENV和ZIKV,目前没有有效的疫苗或者药物,而且病毒间的交叉感染会引起更加严重的后果,因此需要寻找一个具有多种抗病毒功能的药物。蝎子是一种古老的生物,有4亿多年的进化史,在长期的进化过程中其尾部形成了具有可以喷射毒液的毒腺。蝎毒液的成分十分复杂,功能也多种多样,包括离子通道调节剂、蛋白酶类、蛋白酶抑制剂、抗菌肽和抗病毒肽等。大多数抗病毒的蝎毒素多肽都是通过直接杀病毒或者损伤病毒的包膜来抑制病毒的感染。蝎子是一味名贵药材,在我国民族医药中有上千年的药用史,能够治疗诸多疾病,尤其以尾部毒腺活性最佳,如明代李时珍在《本草纲目》明确记载:蝎尾、蝎梢,其力尤紧。因此,蝎尾腺毒液中富含的蝎毒素多肽是一个宝贵的药物资源。本论文首先将从云南蒙自采集的壮真蝎毒腺cDNA文库中筛选获得的蝎毒素多肽基因Ev37克隆到重组表达载体pET-32a中,以原核表达的方式在大肠杆菌表达菌BL21（DE3）中进行表达,并经过镍柱亲和层析、酶切、高效液相色谱纯化、MOLDI-TOF MS质谱分析等对重组壮真蝎毒素多肽Ev37进行了纯化和鉴定,得到了纯度大于95%以上的重组壮真蝎毒素多肽Ev37。进一步以与其序列同源性为55.26%的蝎毒素多肽Hge36为模板,通过SWISS-MODEL方法对壮真蝎毒素多肽Ev37进行了结构模拟预测,发现其具有典型的以α螺旋与β折叠组成的CSαβ的motif结构特征。通过圆二色谱分析了重组壮真蝎毒素多肽Ev37的二级结构,发现壮真蝎毒素多肽Ev37的确含有α螺旋与β折叠结构。壮真蝎毒素多肽Ev37与之前报道的有抗DENV-2活性的帝王蝎毒素多肽Scorpine的蛋白序列有50%的同源性,因此检测了壮真蝎毒素多肽Ev37对DENV-2的抗病毒活性。壮真蝎毒素多肽Ev37在非细胞毒性(CC50=116.3μM)的浓度下对DENV-2的感染具有浓度依赖的抑制作用,无论是细胞内DENV-2的RNA和蛋白水平或者是细胞上清中的病毒数量都呈现浓度依赖的下降。而且发现在一定的病毒感染复数范围内,壮真蝎毒素多肽Ev37均可以抑制DENV-2的感染,并且效果类似。用qRT-PCR的方法对DENV-2感染过程的逐步分析检测发现,壮真蝎毒素多肽Ev37对DENV-2的吸附和核酸复制过程没有影响,对DENV-2的病毒颗粒的感染性影响也不大,主要是抑制DENV-2进入宿主细胞的过程。由于DENV-2主要通过clathrin介导的内吞作用进入宿主细胞,因此检测了壮真蝎毒素多肽Ev37对clathrin表达是否有影响,实验结果发现壮真蝎毒素多肽Ev37对clathrin表达没有影响,说明壮真蝎毒素多肽Ev37不是通过影响clathrin的表达来抑制DENV-2进入宿主细胞。接着,通过共聚焦显微镜（confocal）技术更直观地发现壮真蝎毒素多肽Ev37对DENV-2的吸附过程没有影响。DENV-2进入宿主细胞是首先通过clathrin介导的内吞作用到达早期内吞体,然后在晚期内吞体中低pH条件的诱导下进行病毒膜与内吞体膜的融合释放其基因组到细胞质中。如是通过分子克隆、原核表达与纯化的方法得到了N端带HA标签的壮真蝎毒素多肽Ev37-N-HA,并通过confocal发现Ev37-N-HA多肽可以进入细胞并且呈聚集状分布,且其可以和早期以及晚期内吞体发生很好的共定位。H3多肽是已知的通过内吞作用进入细胞的一个多肽,细胞器的酸化影响H3多肽的内吞体逃逸和在细胞质中的分布,如酸化抑制剂Bafilomycin A1（BAF）可以使原来在细胞质中呈均匀分布的H3多肽变为聚集状分布,然后实验结果发现壮真蝎毒素多肽Ev37同样可以使H3多肽在细胞质中呈聚集状分布,且效果明显强于酸化抑制剂BAF,这个结果提示壮真蝎毒素多肽Ev37能够影响细胞器（内吞体）的酸化。接着发现壮真蝎毒素多肽Ev37可以使DENV-2的包膜蛋白E与晚期内吞体的标记物Rab7的共定位增加,说明壮真蝎毒素多肽Ev37可能通过抑制内吞体酸化使DENV-2病毒颗粒阻滞于晚期内吞体中。再通过流式细胞术的方法和酸敏感染料Lysosensor Green,显示壮真蝎毒素多肽Ev37和BAF可以使荧光值与对照相比向左偏移,证实壮真蝎毒素多肽Ev37抑制了细胞内酸性细胞器的酸化程度。进一步通过confocal发现,壮真蝎毒素多肽Ev37和酸化抑制剂BAF均可使细胞质中酸性细胞器的体积变大而对非酸性细胞器的体积没有影响,再一次证明了壮真蝎毒素多肽Ev37抑制了细胞内的酸性细胞器的酸化,从而阻断了病毒膜与内吞体膜的融合释放其基因组到细胞质中的过程,最终达到了抗DENV-2的作用。然后检测了壮真蝎毒素多肽Ev37对HCV、ZIKV、Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV-1）、仙台病毒（SeV）和腺病毒（Ad V）等其它多种病毒的抗病毒活性,研究其抗病毒功能的广谱性和特异性。壮真蝎毒素多肽Ev37抗病毒的广谱性体现在壮真蝎毒素多肽Ev37对与DENV-2进入宿主细胞方式（通过低pH依赖的膜融合途径）相似的HCV、ZIKV、HSV-1等病毒均具有浓度依赖的抑制作用,尽管HSV-1属于DNA病毒而不是正链RNA病毒。壮真蝎毒素多肽Ev37抗病毒的特异性体现在其对与DENV-2进入方式不同的仙台病毒SeV和腺病毒Ad V不具有浓度依赖的抑制作用,而且酸化抑制剂BAF也得到了类似的结论。再一次证明了壮真蝎毒素多肽Ev37是通过抑制内吞体酸化来抑制病毒的感染,既具有广谱性,又具有特异性。最后在ZIKV可以感染Ⅰ型干扰素受体敲除的A129小鼠模型上,检测了壮真蝎毒素多肽Ev37在体内的抗病毒活性,结果Ev37多肽发现能够降低感染小鼠的血液、肝脏、脾脏、肾、脑中的ZIKV病毒含量,初步说明在体内壮真蝎毒素多肽Ev37仍然具有抗病毒活性。综上所述,本论文首先原核表达得到了重组壮真蝎毒素多肽Ev37,并对其抗病毒功能进行了研究,发现其与大部分蝎毒素多肽的抗病毒方式不同,不是通过作用于病毒本身发挥抗病毒功能,而是通过抑制内吞体酸化来影响DENV-2、HCV、ZIKV、HSV-1等进入宿主细胞方式相似且通过低pH依赖的膜融合过程释放其基因组的病毒感染,而对通过在中性pH条件下直接膜融合的SeV和由自身蛋白破坏内吞体膜而使病毒进入细胞质的Ad V没有抑制活性。这些研究工作为预防和控制DENV-2、HCV、ZIKV、HSV-1等以低pH依赖的膜融合进入宿主细胞的病毒提供了新的策略和思路。