狂犬病是一种严重危害人类的人畜共患病,每年报告约有59,000人死于狂犬病。目前,流浪狗已成为了狂犬病病毒（RABV）主要的传播途径之一,蝙蝠、狐、狼、鼬獾等野生食肉动物是RABV的天然宿主,这些狂犬病毒携带动物对人类和家畜存在潜在的公共卫生风险。为了从源头控制病毒传播,需为这些传播源接种疫苗。然而目前狂犬疫苗接种大多使用肌肉注射,此类接种方式成本高,在许多发展中国家未能广泛使用,另一方面目前狂犬疫苗的免疫效价仍有待提高。因此研究出一种既安全有效且又具有成本效益的口服狂犬病疫苗是十分必要的。牛疱疹病毒一型（Bovine herpes virus type Ⅰ,BHV-1）为双链DNA病毒,其中g E糖蛋白为病毒复制的非必须蛋白,缺失g E基因并不影响病毒复制及其免疫原性。当前缺失g E基因的BHV-1疫苗已在欧洲广泛使用,因此缺失g E基因的BHV-1作为构建重组狂犬病毒的载体具有安全性。本研究基于CRISPR-Cas9及同源重组技术,将牛疱疹病毒I型（Bovine herpes virus type Ⅰ,BHV-1）作为载体,构建缺失g E基因、并表达增强绿荧光蛋白基因（EGFP）、狂犬病毒G基因的重组病毒（BHV-1Δg E/EGFP+/G+）,利用小向导RNA（small guide RNA,sg RNA）将BHV-1Δg E/EGFP+/G+病毒基因组中的EGFP基因敲除,最终获得重组病毒BHV-1Δg E/G+。经测序及Western blot结果表明重组病毒构建成功且可稳定表达狂犬病毒G蛋白。体外生物学特性分析显示,BHV-1Δg E/G+与BHV-1生长特性相似。但在噬斑形态比较中BHV-1Δg E/G+的噬斑明显大于BHV-1,并通过细胞调亡实验证明重组病毒BHV-1Δg E/G+可促进细胞凋亡。通过流式细胞技术检测小鼠口服重组病毒后,其颌下淋巴结中DC、B细胞数量变化,结果表明DC、B细胞数量均上升,重组病毒可产生良好免疫反应。最后将重组病毒BHV-1Δg E/G+分别通过肌内注射和口服两种方式免疫小鼠,用RABV攻毒株（CVS-11）进行肌内注射攻毒。结果表明通过肌内接种与通过口服接种时小鼠存活率相同且存活率高达71%,并且重组病毒通过口服可产生有效中和抗体。以上研究结果表明,成功构建的重组病毒BHV-1Δg E/G+是用于人和动物的新一代口服重组狂犬病疫苗的优良候选物,BHV-1是口服疫苗的理想载体。