肺癌是威胁人类健康最严重的恶性肿瘤之一。权威统计显示全球新发肺癌患者超过200万人,发病率和死亡率均为肿瘤之首。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）占全部肺癌病例的80%以上,而肺腺癌（Lung adenocarcinoma,ADC,LUAD）则是NSCLC最主要的亚型,超过40%。肺腺癌的进展与多种癌基因和肿瘤抑制基因的改变有关,尽管肺腺癌的诊断和治疗有了明显改善,尤其是精准靶向治疗的研究和应用改善了许多患者的生存质量,肺腺癌的总体生存率有所提升,但其预后仍然不容乐观。此外,肺腺癌的潜在机制尚未完全阐明,阻碍了肺腺癌的靶向治疗。因此,深入地开展肺癌分子机制的研究,寻找与肺腺癌预后相关的新分子标志物对提高患者的治疗和生存率具有重要的临床现实意义。近年来,AHNAK家族在肿瘤进展中的作用受到越来越多的关注。作为该家族的一员,AHNAK表达上调与喉癌、间皮瘤和胰腺导管癌的预后不良密切相关。有趣的是,在黑色素瘤、乳腺癌、胃癌和肺癌中,AHNAK可能发挥抑癌作用。AHNAK2（AHNAKNucleoprotein 2）,又名C14orf78,是AHNAK家族的另外一员。AHNAK2最初在小鼠的心脏提取物中发现,编码一个分子量超过600KDa的巨型蛋白,主要包括三个结构域:N-末端PDZ结构域（盘状同源区域）、中央重复单元（central repeating unit,CRU）中心区和C-末端结构域。AHNAK可能在血脑屏障形成,细胞结构和迁移,心脏钙通道调节和肿瘤转移等多种生物学过程中起调节作用,而作为AHNAK的同源物,AHNAK2的生物功能研究比较缺乏。文献报道称AHNAK2通过与轴周蛋白形成缠绕的同源二聚体参与细胞外基质和细胞骨架的链接。成纤维细胞生长因子1（Fibroblast Growth Factor 1,FGF1）是一种非经典释放的生长因子,在调控细胞生长,肿瘤侵袭,血管生成发挥重要作用,并且可以参与MAPK-ERK等信号通路的调节。研究指出AHNAK2和FGF1共定位于细胞膜附近,是调节FGF1非经典运输中的重要组成元件。一项研究报道SMYD2可以将AHNAK2的中心CRU区多个位点甲基化,可能参与调节细胞粘附,肿瘤细胞的迁移和侵袭等过程。AHNAK2在肿瘤中的作用逐渐被重视,近来多项研究提示AHNAK2可作为多种肿瘤预后的分子标记物,如甲状腺癌,黑色素瘤,胰腺导管癌,膀胱癌等。研究证实,AHNAK2在黑色素瘤中高表达,AHNAK2的表达缺失抑制了PI3K和AKT的磷酸化,并抑制了黑色素瘤细胞的转移和增殖。上海交通大学一团队对AHNAK2在肾透明细胞癌中的作用进行了较为深入的研究,AHNAK2在肾透明细胞癌中表达升高,敲除AHNAK2基因表达抑制了脂质合成,进而抑制肿瘤细胞的代谢。低氧条件下,HIF-1α诱导AHNAK2在肾透明细胞癌细胞中表达上调,并通过提升上皮-间充质细胞转化（EMT）和肿瘤干细特性促进肾透明细胞癌的进程。这些研究提示,AHNAK2作为重要的信号转导分子,可能在调节肿瘤的进程中扮演重要的角色。然而,AHNAK2在肺腺癌中的具体作用尚不清楚。基于以上情况,本课题拟探索AHNAK2在肺腺癌中的作用。研究分为三部分,第一部分通过病理标本及临床资料明确AHNAK2在肺腺癌中的表达以及同患者预后的关系。第二部分通过生物信息学分析,进一步验证AHNAK2在肺腺癌中的异常表达情况,并分析异常表达的AHNAK2同肺腺癌不良预后的联系以及其预测患者预后价值。进一步,通过功能富集分析,初步探索AHNAK2在肺腺癌中生物学作用。第三部分通过细胞实验,在体外干预AHNAK2的表达,观察敲低的AHNAK2对肺腺癌A549细胞迁移的影响以及潜在的作用机制。本研究旨在AHNAK2对肺腺癌进程中的作用,以期为肺腺癌提供一个潜在的预后标记物和治疗靶点。第一部分 肺腺癌组织中AHNAK2的表达及预后分析目的:探究AHANK2在肺腺癌中的表达情况以及对患者预后的影响。方法:1.患者标本及资料收集:本研究收集了 2例邢台市人民医院住院治疗经手术切除明确诊断的肺腺癌患者的石蜡切片病理标本进行预实验,并购置了上海卓灏医药公司（SuperBiotek,shanghai）肺腺癌生存期病理组织阵列芯片（LUC1601）。该芯片纳入了 2002年11月至2012年12月收集的80例肺腺癌患者,包含了肿瘤组织、临近癌旁组织、详细的临床资料和随访信息（随访时间至2019-8）。通过免疫组化检测AHNAK2在肺腺癌中的表达,利用免疫组化评分评估AHNAK2的表达水平,探索AHNAK2在肺腺癌中的表达情况以及同临床预后的关系。2.免疫组化评判标准:染色强度和染色程度的得分乘积范围是0-12分,其中0-4分判定为AHNAK2低表达,≥6分判定为高表达。3.统计学分析:采用单因素和多因素COX回归分析评价参数与临床预后的关系。P＜0.05被认为具有统计学差异。结果:邢台市人民医院收集的经手术切除的病理标本中,AHNAK2的染色强度明显强于临近的癌旁组织。肺腺癌组织阵列芯片共包含80例患者,其中5例由于临床资料不完整或肿瘤组织样本缺失,而未被纳入研究。在余下的75例中,有12例邻近的正常组织标本缺失。研究结果显示,在63例样本中,与相邻的正常组织对比,AHNAK2在肺腺癌组织中表达显著上调（P＜0.001）。在75例肿瘤样本中,通过Kaplan-Meier生存曲线证实AHNAK2高表达与总生存率低显著相关（P=0.002）。单因素COX分析显示淋巴结转移（P＜0.001）,TNM分期（p=0.004）,AHNAK2表达（P=0.017）与预后显著相关。多因素COX回归分析显示AHNAK2是判断肺腺癌患者预后的独立因子（p=0.005）。小结:AHNAK2在肺腺癌组织中表达上调并与患者的不良预后显著相关。第二部分 利用生物信息学分析AHNAK2在肺腺癌进程中的意义并探索其潜在的生物学功能目的:通过公共数据库收集肺腺癌数据集,利用生物信息学分析验证AHNAK2在肺腺癌中的表达及意义,并通过功能富集分析,探索AHNAK2在肺腺癌进程中的生物学作用。方法:1.生物信息学数据库我们筛选了TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库,GEO（Gene Expression Omnibus）数据库、CPTAC（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium）数据库、GTEX（The Genotype Tissue Expression）数据库、Oncomine数据库以及CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia）数据库的相关数据集进行了生物信息学分析。2.临床预后预测模型的构建及验证我们选择GES26939作为训练集,TCGA-LUAD和GSE72094用于验证集。以年龄、性别、TNM分期和ANHAK2作为因子,通过R语言“rms”包构建了临床预测模型列线图。并通过一致性指数（C-index）、校准曲线、时间相关ROC和决策树分析验证模型预测预后的价值。3.生物学功能分析我们利用CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia）中肺癌细胞系数据以及TCGA-LUAD对与AHNAK2表达密切相关的基因进行了筛选。以皮尔逊相关系数绝对值大于等于0.3（|r|≥0:3）为标准,利用R语言共筛选出交叉表达于两个数据库的共有148个基因。通过功能富集分析,我们探索了AHNAK2潜在的生物学功能。4.统计分析卡方检验、t检验均由R语言完成,P值＜0.05被认为具有统计学意义。结果:1.与正常肺组织相比,肺腺癌中AHNAK2的mRNA和蛋白质的表达水平更高。2.AHNAK2的高表达提示预后不良,并且可以作为判断预后独立因素。3.以AHNAK2为因子构建的临床预测模型对肺腺癌患者预后具有较高的应用价值。4.肺腺癌中AHNAK2与细胞黏附功能的调节密切相关。小结:1.AHNAK2在肺腺癌组织中表达上调并与不良预后显著相关2.AHNAK2可能参与调控肺腺癌细胞的黏附和迁移。第三部分 AHNAK2促进肺腺癌侵袭转移潜在机制的初步探讨目的:通过小干扰RNA敲低AHNAK2,探讨AHNAK2下调对肺腺癌A549细胞迁移的影响及潜在的作用机制方法:1.细胞培养及转染我们从武汉普诺赛生命科技有限公司获得了A549细胞系。并利用LipofectamineTM RNAiMAX对siRNA进行转染,并利用转染后的细胞进行相关实验。2.细胞免疫荧光我们使用了两种转染浓度对三个干扰位点进行了效力检测。通过细胞免疫荧光反应各组A549细胞中AHNAK2表达情况。利用Image J软件对分析对比荧光强度,筛选具有最佳效力的干扰位点和转染浓度。3.细胞划痕实验将A549细胞培养于在6孔板中,利用siRNA敲低AHNAK2表达,通过显微镜观察划痕愈合情况。4.免疫固定电泳实验将A549细胞进行转染siRNA,继续培养48h后收集细胞蛋白通过western blot检测。观察AHNAK2敲低后AKT和P-AKT蛋白表达水平的变化。结果:1.荧光显微镜观察到AHNAK2在A549细胞中表达。2.与对照组相比,小干扰RNA组的划痕愈合明显下降,提示AHNAK2的缺失抑制肺腺癌细胞的迁移。3.敲低AHNAK2后,P-AKT表达明显下降。小结:AHNAK2的下调抑制了肺腺癌细胞的迁移,这一过程可能与AKT信号通路失活相关。结论:1.AHNAK2在肺腺癌癌组织中异常高表达并与肺腺癌患者的不良预后显著相关。2.AHNAK2可能是判断肺腺癌预后的独立指标,可以较好地预测肺腺癌生存期。3.AHNAK2的下调抑制了肺腺癌细胞的迁移。4.AHNAK2可能通过介导AKT信号通路参与细胞黏附功能的调控,从而影响肺腺癌的侵袭和转移。