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目的:蛋白磷酸酶2A(PP2A)是真核细胞内最主要的蛋白磷酸酶之一,主要对细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白发挥去磷酸化作用。而C亚基(PP2Ac)作为PP2A的催化亚基,是PP2A发挥去磷酸化作用的关键亚基,亮氨酸羧基甲基转移酶1(LCMT1)和蛋白甲基酯酶(PPME-1)分别调控亮氨酸309位点的甲基化/去甲基化修饰,共同调节PP2A的生物学功能。目前PP2A的C亚基甲基化修饰对M1型巨噬细胞极化的影响未见明确报道。线粒体是细胞内自噬发生的重要细胞器,线粒体自噬通过清除损伤的线粒体维持细胞内糖脂代谢的动态平衡,参与细胞增殖、分化及疾病的发生发展。因此,本文采用体外构建M1型巨噬细胞极化模型,通过PPME-1抑制剂ABL127抑制PPME-1的活性增加PP2Ac甲基化,同时利用LCMT1 siRNA降低PP2Ac甲基化,从线粒体自噬及糖酵解代谢初步探讨PP2Ac甲基化调控在M1型巨噬细胞极化中的作用及其机制。方法:1.PP2Ac甲基化修饰在M1型巨噬细胞极化中的作用1.1 PP2Ac甲基化在M1型巨噬细胞极化中的变化(1)用100nM佛波酯(PMA)诱导人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1细胞)24小时刺激极化为M0型巨噬细胞,再联合使用10ng/ml脂多糖(LPS)、20ng/ml干扰素γ(IFN-γ)刺激48小时极化为M1型巨噬细胞。(2)利用倒置显微镜观察M1型巨噬细胞极化形态学变化。(3)极化完成后抽提细胞总mRNA,实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞极化相关基因标志物环加氧酶-2(COX-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、CXC趋化因子配体10(CXCL-10)基因mRNA的表达情况。(4)蛋白免疫印迹法检测PP2Ac甲基化在M1型巨噬细胞中的表达情况。1.2 PP2Ac甲基化修饰对M1型巨噬细胞极化的影响(1)实时荧光定量PCR检测ABL127、LCMT1 siRNA干预对M1型巨噬细胞亮氨酸羧基甲基转移酶1(LCMT1)基因的mRNA表达情况。(2)蛋白免疫印迹法检测ABL127、LCMT1 siRNA干预对M1型巨噬细胞PP2Ac甲基化修饰相关蛋白表达的影响。(3)倒置显微镜观察ABL127、LCMT1 siRNA干预对M1型巨噬细胞极化形态学变化。(4)qPCR检测AJ3L127、LCMT1 siRNA干预对M1型巨噬细胞极化基因表达的影响。1.3中性红法检测ABL127、LCMT1 siRNA干预对M1型巨噬细胞吞噬功能的影响2.PP2Ac甲基化修饰在M1型巨噬细胞线粒体自噬中的作用(1)利用荧光显微镜及荧光酶标仪检测M1型巨噬细胞分化中溶酶体(自噬溶酶体)及线粒体的变化情况,免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3及PINK1的表达,观察自噬的发生情况。(2)利用荧光显微镜检测ABL127及LCMT1 siRNA干预对线粒体膜电位的影响以及荧光酶标仪检测对M1型巨噬细胞ROS的影响。(3)蛋白免疫印迹法检测ABL127及LCMT1 siRNA干预对自噬/线粒体自噬相关蛋白 Beclin-1、p62、LC3、PINK1、Parkin、VDAC1 及 NLRP3的表达情况。3.PP2Ac甲基化修饰调节糖酵解代谢对M1型巨噬细胞极化的影响采用微量法检测PP2Ac甲基化修饰对M1型巨噬细胞糖酵解途径相关代谢酶己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)酶活性的影响。结果:1.PP2Ac甲基化修饰在M1型巨噬细胞极化中的作用1.1 PP2Ac甲基化在M1型巨噬细胞极化中的变化(1)M0型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞后,细胞由最初的类圆形逐渐伸出伪足呈梭形。(2)M1模型组表面标志物COX-2、TNF-α、IL-6、CXCL-10的基因表达水平明显高于M0型对照组,差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)M0型巨噬细胞极化为M1型,PPME-1、PP2Ac去甲基化表达下降,LCMT1、PP2Ac甲基化表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。1.2 PP2Ac甲基化修饰对M1型巨噬细胞极化的影响(1)与溶剂对照组相比,ABL127干预M1型巨噬细胞,LCMT1的基因mRNA表达明显增高,差异具有统计学意义(p<0.05);总的PP2Ac和PPME-1蛋白表达水平没有明显差异(p>0.05),PP2Ac去甲基化下降,而PP2Ac甲基化增加,LCMT1基因表达和蛋白表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05);LCMT1siRNA沉默组,与沉默阴性对照组相比,LCMT1的基因mRNA表达明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05);总的PP2Ac蛋白表达无明显差异,LCMT1、PP2Ac甲基化下降,差异具有统计学意义(p<0.05),PPME-1、PP2Ac去甲基化无明显变化。(2)与溶剂对照组相比,ABL127干预能明显促进M1型巨噬细胞伸出伪足和展开,镜下梭形样细胞增多;siRNA LCMT1沉默组,与阴性对照组相比,能明显抑制巨噬细胞伪足的伸出,梭形样细胞减少。(3)与溶剂对照组相比,ABL127干预后,M1型巨噬细胞相关基因标志物COX-2、TNF-α、IL-6、CXCL-10的mRNA表达进一步增加,差异具有统计学意义(p<0.05);LCMT1 siRNA沉默组,与阴性对照组相比,(COX-2、TNF-α、IL-6、CXCL-10的基因表达量明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。1.3 PP2Ac甲基化修饰对M1型巨噬细胞吞噬功能的影响M1型巨噬细胞吞噬功能明显高于M0型巨噬细胞,ABL127处理后吞噬功能高于溶剂对照组,差异具有统计学意义(p<0.05);LCMT1siRNA沉默组,与阴性对照组相比,吞噬功能明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.PP2Ac甲基化修饰在M1型巨噬细胞线粒体自噬中的作用(1)M0型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞,溶酶体/自噬溶酶体数量随极化时间的延长逐渐增多,线粒体数量则逐渐下降,差异具有统计学意义(p<0.05);而线粒体自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达升高,Beclin-1、PINK1表达升高,p62下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。ABL127干预M1型巨噬细胞后,其溶酶体数量进一步增多,线粒体数量进一步下降,差异具有统计学意义(p<0.05);LCMT1 siRNA沉默组,与阴性对照组相比,溶酶体数量下降,线粒体数量增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。(2)与M0型巨噬细胞相比,极化为M1型巨噬细胞后,结果显示线粒体膜电位下降,细胞内ROS升高,差异具有统计学意义(p<0.05);经ABL127处理,与溶剂对照组相比,膜电位增高,细胞内ROS下降,LCMT1 siRNA沉默组,与阴性对照组相比,膜电位进一步下降,ROS升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)蛋白免疫印迹检测线粒体自噬相关蛋白表情情况,结果显示,M0型极化为M1型巨噬细胞后,总的PP2Ac无明显差异(p>0.05),PP2Ac去甲基化下降,甲基化PP2Ac增加,自噬相关蛋白Beclin-1升高,p62下降,LC3Ⅱ/LC3I表达升高,线粒体自噬相关蛋白PINK1、VDAC1升高,Parkin下降,NLRP3表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05);经ABL127处理后,与溶剂对照组相比,PP2Ac去甲基化修饰下降,PP2Ac甲基化进一步增加;Beclin-1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、PINKI、VDAC1、NLRP3 的表达进一步升高,而Parkin表达进一步下降,差异具有统计学意义(P<0.05);而LCMT1 siRNA沉默组,与阴性对照组相比,PP2Ac甲基化、Beclin-1、LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1、VDAC1、NLRP3的表达下降,而Parkin表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.PP2Ac甲基化修饰调节糖酵解代谢对M1型巨噬细胞极化的影响微量法检测M1型巨噬细胞内糖酵解相关限速酶活性。结果显示,M1型巨噬细胞糖酵解代谢相关酶活性中丙酮酸激酶(PK),乳酸脱氢酶(LDH)的活性明显高于M0型巨噬细胞(p<0.05);ABL127处理后,与溶剂对照组相比,己糖激酶(HK)各组间无显著性差异(p>0.05),而PK、LDH的活性升高,差异具有统计学意义(p<0.05);而LCMT1 siRNA沉默组,与阴性对照组相比,HK、PK、LDH的活性明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1.PP2Ac甲基化能促进M1型巨噬细胞相关基因标志物COX-2、TNF-α、IL-6、CXCL-10的mRNA表达和吞噬功能,增强M1型巨噬细胞极化水平。2.PP2Ac甲基化可促进M1型巨噬细胞线粒体自噬,保护线粒体膜电位,降低细胞内ROS的水平。3.PP2Ac甲基化可通过促进线粒体自噬提高M1型巨噬细胞糖酵解代谢酶活性进而促进M1型巨噬细胞的极化水平。