【摘 要】
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研究目的蛋白激酶c结合蛋白1（Protein kinase c-binding protein 1,PICK1）在急性肾损伤中扮演着极其重要的作用,本研究重点探究PICK1在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导脓毒症肾损伤（Sepsis Associated Acute Kidney Injury,SA-AKI）中的作用及其机制。研究方法1.体外实验研究:使用LPS诱导人肾小
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研究目的蛋白激酶c结合蛋白1（Protein kinase c-binding protein 1,PICK1）在急性肾损伤中扮演着极其重要的作用,本研究重点探究PICK1在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导脓毒症肾损伤（Sepsis Associated Acute Kidney Injury,SA-AKI）中的作用及其机制。研究方法1.体外实验研究:使用LPS诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）构建脓毒症肾损伤细胞模型。（1）通过免疫印迹（Western Blot,WB）及聚合酶链式反映（PCR）检测不同处理组PICK1的表达情况。（2）转染慢病毒敲低PICK1后,采用Hoechst 33258染色和流式细胞技术检测不同处理组细胞凋亡情况。（3）采用WB检测凋亡相关蛋白以及凋亡信号通路蛋白的表达差异。（4）通过DCFH-DA和GSH试剂盒分别对细胞内活性氧水平（ROS）以及谷胱甘肽（GSH）含量变化进行观察。（5）加用活性氧清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）后,采用流式细胞技术检测ROS含量和细胞凋亡情况并通过WB技术检测凋亡相关蛋白表达。2.体内实验研究:使用成年野生型（WT）雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄,20-25g）分别通过腹腔注射脂多糖（LPS 10mg/kg）构建脓毒症肾损伤动物模型。（1）采取肾脏组织通过WB和免疫荧光技术（IF）来检测不同实验组中PICK1的表达情况。（2）采集血液标本检测肌酐、尿素氮评估小鼠的肾功能。通过HE染色来评估肾脏病理损伤情况。（3）通过TUNEL试验检测肾小管上皮细胞凋亡情况;免疫组化和WB技术检测不同分组中肾组织凋亡相关蛋白和凋亡通路蛋白的表达情况。结果（1）PCR和WB技术检测不同浓度的LPS处理细胞24h时PICK1在HK-2细胞中的表达情况显示,15μg/ml LPS处理时PICK1的表达量达到高峰。使用LPS（15μg/ml）处理不同时间后检测结果显示,在处理24h时PICK1的表达量达到高峰。（2）慢病毒转染HK-2细胞敲低PICK1后,流式细胞技术、Hoechst 33258染色结果显示sh-PICK1组细胞凋亡数量较NC组明显增多。WB结果显示sh-PICK1组的促凋亡蛋白BAX,Cleaved-Caspase3的表达升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降。（3）敲低PICK1后,发现谷胱甘肽（GSH）的含量在sh-PICK1组明显少于NC组。流式细胞技术检测细胞内ROS的生成情况结果显示sh-PICK1组的ROS含量远高于NC组。WB检测结果显示凋亡通路蛋白p38MAPK和ASK1的表达在sh-PICK1组中明显升高。（4）使用活性氧清除剂NAC后,流式细胞技术结果显示细胞内ROS含量和细胞凋亡数量较未使用组明显减少,且WB结果显示凋亡相关蛋白和通路蛋白的表达较未使用组显著减少。（5）体内实验同样发现,PICK1在脓毒症肾损伤小鼠模型中显著升高。（6）使用PICK1特异性抑制剂FSC231后,血浆肌酐、尿素氮明显升高,HE染色提示肾脏组织结构破坏加重,TUNEL染色显示肾小管上皮细胞凋亡增加。（7）免疫组化和WB结果发现促凋亡蛋白Cleaved-caspase 3和通路蛋白p38MAPK、ASK1表达显著上升。结论PICK1可以减轻LPS诱导的脓毒症小鼠肾损伤,其机制可能是PICK1通过增加脓毒症肾小管上皮细胞GSH含量来减少ROS生成,减轻细胞的氧化应激反应,最终减少细胞凋亡。
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