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背景和目的:葛根素作为从中药野生葛根中提取的天然活性产物,因其在临床应用上表现出多靶点作用,目前广泛用于多种心血管疾病的治疗,如动脉粥样硬化、缺血性心肌病、心肌肥厚以及心律失常等。研究显示,葛根素可有效改善脓毒症引起的心肌损伤,但其心肌保护作用的机制研究并不全面,目前认为主要与抑制炎症反应及氧化应激等机制有关。铁依赖性铁死亡是一种新发现的脂质氧化调控的细胞死亡模式,与传统的细胞死亡模式不同,其发生机制主要是与铁死亡促进剂（Erastin）抑制胱氨酸进入细胞内有关,导致谷胱甘肽耗竭和谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）失活,进而大量Fe2+进入线粒体,产生大量活性氧（ROS）,最终导致细胞死亡。已证实铁死亡在多种原因引起的心肌损伤中起着关键作用,如糖尿病心肌病、缺血性心肌病以及脓毒症心肌损伤等。研究显示,脓毒症发生后,脂多糖（LPS）通过与位于免疫细胞及其它细胞上的Toll样受体（TLRs）相互作用,从而促使机体产生大量炎性细胞因子,影响线粒体内氧化呼吸链的偶联过程,进一步导致ROS的增多从而促进氧化应激反应发生对心肌细胞造成损伤,同时,ROS的蓄积又可引起铁死亡的发生,从而导致了细胞死亡。因此,抑制铁死亡的发生发展可改善脓毒症心肌损伤。目前认为,多种信号通路均可调控铁死亡的发生,其中AMPK信号通路是其调控通路之一,激活该通路可抑制铁死亡的发生发展。而研究显示,葛根素可通过激活AMPK信号通路进而改善多种心肌疾病,包括病理性心肌肥厚和心肌缺血损伤等。因此,我们推测葛根素可以通过活化AMPK信号通路进而抑制炎症反应、氧化应激以及铁死亡的发生从而减轻LPS诱导的心肌损伤。综上所述,本研究的目的是首先通过离体细胞明确葛根素对脓毒症心肌损的保护作用,并进一步通过在体动物实验验证葛根素是否通过活化AMPK信号通路抑制铁死亡改善脓毒症心肌损伤,为明确其作用机制提供理论依据。方法:1.第一部分:葛根素对LPS诱导的H9c2细胞毒性损伤的保护作用。根据处理方法不同,将H9c2细胞分成5组:对照组、脓毒症组（LPS组）、脓毒症+葛根素组（LPS+Pue组）、脓毒症+葛根素组+铁死亡促进剂（LPS+Pue+Era组）以及脓毒症+葛根素组+AMPK抑制剂Compound C（LPS+Pue+CC组）。测定上清液中乳酸脱氢酶（LDH）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平以及铁离子含量;观察细胞活力以及细胞凋亡情况;测定心肌细胞中谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）以及磷酸化AMPK（P-AMPK）的表达水平。2.第二部分:葛根素抑制铁死亡介导的脓毒症心肌损伤。将36只健康雄性SD大鼠随机分为四组:对照组、脓毒症组（LPS组）、脓毒症+葛根素组（LPS+Pue组）和脓毒症+葛根素组+铁死亡促进剂（LPS+Pue+Era组）。除对照组腹腔注射等量生理盐水外,分别使用葛根素（Pue）以及葛根素联合铁死亡促进剂（Era）对脓毒症大鼠进行处理;采样前行超声心动图评估心功能;测定血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白I（c Tn I）及乳酸脱氢酶（LDH）的水平以及大鼠心肌组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）、还原性谷胱甘肽（GSH）和脂质过氧化酶（MDA）的活性;观察心肌组织的病理变化;测定心肌组织中谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）、铁蛋白（Ferritin）、转铁蛋白受体（TFR）、磷酸化AMPK（P-AMPK）的表达水平以及铁离子含量;测定凋亡蛋白（Cleaved-caspase3）、促凋亡蛋白（Bax）、抗凋亡蛋白（Bcl-2）的表达水平;TUNEL法染色法观察大鼠心肌细胞凋亡情况。3.第三部分:葛根素通过激活AMPK信号通路抑制铁死亡。将12只健康雄性SD大鼠随机分为四组:对照组、脓毒症组（LPS组）、脓毒症+葛根素组（LPS+Pue组）和脓毒症+葛根素组+AMPK抑制剂Compound C（LPS+Pue+CC组）。分别使用Pue以及Pue联合AMPK抑制剂Compound C（CC）对脓毒症大鼠进行处理。测定心肌组织中铁蛋白（Ferritin）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）、谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）、转铁蛋白受体（TFR）、磷酸化AMPK（P-AMPK）的表达水平以及铁离子含量。结果:1.第一部分:1.1葛根素可以改善LPS诱导的H9c2细胞损伤,降低LDH及TNF-α的水平,减少细胞凋亡,上调GPX4的表达水平并降低铁离子含量。1.2葛根素的脓毒症心肌保护作用可被铁死亡促进剂Era以及AMPK抑制剂CC废除。2.第二部分:2.1葛根素可以下调大鼠血清中心肌损伤标记物CK-MB、LDH和c Tn I的浓度。并且通过观察HE切片发现,葛根素可以减轻LPS诱导的心肌组织损伤。2.2葛根素可以改善LPS模型大鼠的左室射血分数和左室短轴收缩率。葛根素可以抑制LPS诱导的炎症反应,并且可以下调炎症因子IL-6、IL-10和TNF-α的表达。葛根素可以抑制LPS诱导的氧化应激反应,上调抗氧化指标GSH和SOD的表达以及抑制脂质过氧化指标MDA的表达。2.3检测各组大鼠凋亡相关蛋白和观察TUNEL染色结果,结果显示葛根素可以促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,并抑制凋亡蛋白Cleaved-caspase3和Bax的表达,进而减少心肌细胞凋亡。2.4葛根素可以促进LPS大鼠模型心肌组织中GPX4和Ferritin的表达,并且抑制ACSL4和TFR的表达。此外葛根素还可促进心肌组织中AMPK的磷酸化,并且铁死亡促进剂Era对AMPK的磷酸化无影响。铁死亡促进剂Era可抑制葛根素的抗炎、抗氧化应激和抗凋亡作用。3.第三部分:3.1葛根素提高了脓毒症大鼠心肌组织中AMPK磷酸化水平。3.2 AMPK抑制剂CC促进了脓毒症心肌组织中铁死亡的发生,且其可废除葛根素对铁死亡的抑制作用。结论:1.离体细胞实验及在体动物实验均证实葛根素可以通过抑制LPS诱导的心肌细胞铁死亡的发生,进而对脓毒症心肌损伤产生保护作用并改善心脏功能。2.葛根素可以上调脓毒症心肌细胞毒性损伤模型中AMPK的磷酸化水平。3.铁死亡促进剂Era和AMPK抑制剂CC均可有效废除葛根素对脓毒症心肌损伤的保护作用。4.葛根素可通过调控AMPK调控的铁死亡信号通路对脓毒症心肌损伤进行保护。