猪链球菌病(Swine streptococcosis)是一种常见的猪传染病,世界各国均有发生,也是一直困扰我国养猪业发展的重要细菌性传染病。临床上主要表现为急性败血症、脑膜脑炎;慢性感染以关节炎、心内膜炎为主要特征。猪链球菌病主要病原为猪链球菌(Ssuis)和马链球菌兽疫亚种(SEZ),其中猪链球菌2型(SS2)是毒力最强,临床分离率最高的血清型之一。近年来,猪链球菌病在我国的流行呈明显的上升趋势,特别是猪群发生猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒疾病、副猪嗜血杆菌病等疫病后易继发或并发该菌感染,带来十分严重的经济损失。同时SS2和SEZ是重要的人畜共患病原菌,严重威胁公共卫生。嗜中性粒细胞是先天性免疫的第一道防线,当机体感染时最先被募集到炎症部位,通过吞噬和脱颗粒的方式杀灭病原微生物。近年来发现嗜中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellulartraps,NETs)通过其网状纤维样结构限制病原菌的移动并提高局部抗菌物质的浓度有效杀灭病原菌。本研究分别从NETs的降解和抑制NETs形成两个方面研究猪源链球菌逃避先天性免疫反应导致菌血症的机制。利用SS2转座子突变体文库筛选SS2抑制NETs形成相关的毒力因子,并对其作用机制进行探索,为阐明SS2逃避先天性免疫反应并进一步解析SS2致病机制提供新思路。1.猪链球菌2型诱导NETs形成的分子机制猪链球菌2型(SS2)可以在体内外环境中诱导NETs形成但其机制尚不清晰。本研究发现SS2与嗜中性粒细胞作用可以刺激活性氧物质(ROS)生成、TLR2和TLR4转录水平显著上调、p38 MAPK和ERK1/2的激活。分别用抑制剂阻断ROS的生成和TLR4信号传递会抑制SS2激活的p38和ERK1/2磷酸化,并抑制NETs形成。用p38 MAPK和ERK1/2抑制剂处理嗜中性粒细胞,SS2诱导NETs形成显著减少。本研究证实在SS2在感染过程中被TLR2和/或TLR4的识别,产生ROS,进而诱导嗜中性粒细胞的p38 MAPK和ERK的磷酸化和NETs形成。2.猪链球菌2型抑制NETs毒力因子鉴定及作用机制本研究利用NETs定量和免疫荧光染色技术筛选SS2转座子突变体文库中筛选到6株诱导NETs形成能力增强的突变株。其中Tn524的相关性状稳定,作为后续研究对象。转座子TnYLB-1插入使插入位点基因失活,经过反向PCR扩增和基因测序鉴定Tn524突变株中TnYLB-1插入失活基因为SS2细胞表面蛋白(CSP)。原核表达重组蛋白CSP不能诱导NETs形成,并且不能抑制PMA诱导的NETs形成。通过pull down实验检测CSP不与细胞蛋白直接结合。⊿CSP缺失株细菌荚膜缺失,并且刺激嗜中性粒细胞ROS和NETs的生成明显增强。与亲本株SS2相比,⊿CSP与嗜中性粒细胞作用,导致细胞TLR2和TLR4的转录水平和ERK1/2磷酸化水平明显上调,但对p38的磷酸化水平没有差异。⊿CSP在体内感染过程中上调NETs正调控相关细胞因子的转录水平如TNF-α、IFN-γ、MIP-2和IL-1β。综上所述,在SS2感染过程中,CSP蛋白不能直接刺激或者抑制NETs的形成,但可以通过促进SS2荚膜的合成,帮助细胞逃避嗜中性粒细胞膜受体TLR2和/或TLR4的识别作用、下调NETs正调控相关细胞因子的转录水平、抑制ROS的生成和嗜中性粒细胞ERK1/2的激活,最终抑制NETs的形成。3.猪链球菌2型生物被膜抑制NETs形成本研究发现体外培养中嗜中性粒细胞促进SS2生物被膜的形成,小鼠体内感染中用生物被膜鉴别培养基分别在小鼠的肝、肾和脾脏中分离到生物被膜态SS2,说明SS2在体内感染过程中会形成生物被膜。小鼠腹腔攻毒模型说明游离态和生物被膜态SS2均可以引起嗜中性粒细胞向感染部位趋化,为研究嗜中性粒细胞和细菌之间的相互作用提供了环境基础。生物被膜态SS2不易被巨噬细胞吞噬,但可以被NETs清除。并且NETs对游离态和生物被膜态SS2的杀菌作用没有明显的区别。生物被膜态SS2可以通过其胞外基质抑制NETs形成。该研究将有利于对生物被膜及其引起的持续性感染提供新的认识。4.马链球菌兽疫亚种胞外核酸酶降解NETs多种细菌分泌胞外核酸酶降解NET DNA骨架,这些核酸酶具有两个特点,一是能够分泌到胞外或锚定在细菌外膜上;二是具有核酸酶活性。SS2分泌胞外核酸酶降解NETs但其降解能力并不完全,马链球菌兽疫亚种(SEZ)也是猪链球菌病的重要病原引起急性败血症,SEZ是否具有类似功能的核酸酶需要进一步研究。本研究通过对SEZ基因组分析,发现其基因组中7个基因同时具有以上两个特点,并且其中基因SESEC_RS04165(产物为核酸酶,ENuc)和SESEC_RS05720(产物为5’-核苷酶,5Nuc)的转录水平明显高于其他五个基因。原核表达相应重组蛋白分别为rENuc和r5Nuc,并发现这两个蛋白同时具有核酸酶活性和核苷酶活性,直接降解小牛胸腺DNA和NETDNA形成脱氧腺苷。并且发现脱氧腺苷对巨噬细胞的吞噬作用具有抑制作用,但不影响巨噬细胞的胞内杀菌作用。双基因缺失株△ENuc△5Nuc的毒力明显低于亲本株SEZ和单基因缺失株△ENuc、△5Nuc;并且通过脏器分布实验发现双基因缺失株△ENuc△5Nuc不能突破血液系统转移至深层脏器中。与亲本株SEZ比较,基因缺失株△ENuc、△5Nuc和△ENuc△5Nuc刺激NETs的能力明显增强,但在NETs中的存活能力减弱。与SS2胞外核酸酶不同的是ENuc和5Nuc使SEZ具有完全降解NETs的能力,它们是SEZ重要的毒力因子,不仅帮助细菌逃避宿主免疫反应,还通过降解宿主成分产生具有毒性的脱氧腺苷损伤宿主免疫细胞的功能。