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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜恶性病变为主要病理特征的系统性全身自身免疫病(Autoimmune disease,AID),其主要表现为小关节滑膜侵袭性、对称性炎症导致的关节损伤,继而导致软骨以及骨的破坏,最终会导致关节僵直、畸形以及功能障碍,其具体发病机制目前尚未阐明。诸多研究表明巨噬细胞是引起RA的关键免疫细胞之一,在RA的发生发展中扮演着重要作用。巨噬细胞是机体抵御外源性损伤的第一道防线。一般认为巨噬细胞起源于单核细胞的分化。但是,近期研究发现,不同组织或者器官中的巨噬细胞并不是完全来自于循环的单核细胞。其中卵黄囊(yalk sac)以及胎肝(fetal liver)是胚胎期巨噬细胞的两种主要起源。关节滑膜巨噬细胞(Synovial macrophages,SM)的起源尚不清楚。重要的是,不同起源的SM,包括胚胎源滑膜巨噬细胞(Embryonic SM,ESM)以及骨髓源滑膜巨噬细胞(Bone marrow SM,BMSM)在RA患者以及在胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)动物模型中的作用还未见报道。因此,本研究主要探讨SM的个体发育以及不同起源的SM在类风湿关节炎中的作用。目的:研究SM的不同起源及个体发育,包括在小鼠胚胎期、围产期、新生期和成年后的动态变化。比较不同起源SM在细胞功能及表型上的差异以及在RA病人滑膜中的表型。方法:1.利用免疫组化法检测CX3CR1+/GFP小鼠胚胎期SM定植于关节处的具体时间。2.流式细胞术检测ESM,BMSM的个体发育、吞噬能力、原位增殖能力。3.qRT-PCR 法检测 ESM、BMSM 中 IL-4(Interleukin-4)、IL-10(Interleukin-10)、TNF-α(Tumor necrosis factor-α)、IL-1β(Interleukin-1β)的表达。4.建立骨髓嵌合体模型检测骨髓细胞对ESM、BMSM 比例的影响。5.用 CCR2(Recombinant Chemokine C-C-Motif RecEPtor 2)基因工具鼠检测BMSM的起源情况。6.流式细胞术及免疫荧光观察ESM及BMSM在小鼠不同个体发育阶段的定植情况。7.用鸡Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂制备CIA模型,利用流式细胞术检测CIA模型病程中ESM、BMSM的比例变化及极化表型。8.用RA患者滑膜验证ESM、BMSM的比例变化及极化表型。结果:1.关节滑膜细胞起源的鉴定。在CX3CR1+/GFP小鼠中对SM的鉴定。荧光结果显示,在E12.5有F4/80+的SM(ESM)定植于小鼠的关节处。另外,通过免疫组化法及流式细胞术也证实这一结果。随着胚胎的发育,ESM逐渐增多,在E20.5检测到F4/80-CD11b+SM(BMSM)。2.ESM及BMSM的个体发育过程。为了探究不同起源SM的个体发育,检测了在小鼠发育的不同时期,包括胚胎期、围产期、新生期以及出成年后四个阶段中小鼠关节中ESM、BMSM的细胞比例。结果显示,随着胚胎的发育在E12.5有F4/80+细胞出现,在围产期(E20.5)有CD11b+细胞出现,F4/80+CD11b-ESM从新生儿期到成年期先下降后上升,然而,F4/80-CD11b+BMSM呈现相反的表达模式,即从新生儿期到成年期先上升后降低。同时还发现了 F4/80+CD11b+的混合细胞群的出现,并且随着个体发育到成年期这部分细胞所占比例会逐渐增加。3.F4/80+CD11b+混合细胞群起源的探究。为了探究这部分混合细胞群的起源,利用Ly6C和MHCII在成年野生型小鼠中鉴定了 F4/80+CD11b+SM细胞群的三个亚群分别是Ly6C-、Ly6C+MHCII-、Ly6C+MHCII+。同时利用CCR2-/-工具鼠来评价外周血中单核细胞对Ly6C+SM的贡献。结果显示,与成年野生型小鼠相比,CCR2-/-小鼠中Ly6C+SM的比例有明显的下降,而来自Ly6C-SM的比例与野生型小鼠相似,提示CCR2的敲除并不影响ESM。4.ESM、BMSM的细胞特性以及功能的比较。为了进一步揭示ESM、BMSM的细胞特性以及功能的差异,分别检测了两种细胞的吞噬能力、原位增殖能力以及抗炎因子和促炎因子的表达情况。利用FITC标记的葡聚糖分别检测ESM、BMSM的吞噬能力,结果显示ESM具有较高的吞噬活性。进一步用Ki67检测其在产前产后的原位增殖能力。结果显示在E16.5ESM具有较高的增殖能力,随着胚胎的发育由出生前到出生后其增殖能力逐渐下降。RT-qPCR结果显示抑炎因子IL-4、IL-10在ESM中具有较高的表达水平,而促炎因子IL-1β、TNF-α在BMSM中有较高的表达水平。另外用骨髓嵌合体模型进一步揭示骨髓细胞对ESM、BMSM 比例的贡献,结果发现BMSM大部分为骨髓移植后的骨髓细胞所代替,而ESM具有一定的抗辐射能力。5.ESM、BMSM在CIA小鼠模型及RA患者滑膜中的作用。为了进一步研究ESM、BMSM在关节炎中的作用,建立CIA小鼠模型以及利用RA患者滑膜分别提取SM。在CIA小鼠的不同发病阶段检测其动态表达模式,结果显示,ESM的比例在炎症初始阶段到高峰阶段逐渐下降,在疾病恢复阶段逐渐上升。然而,BMSM呈现相反的表达模式。另外检测极化模式的差异,结果发现,ESM的极化倾向M2抗炎亚型,而BMSM倾向M1促炎亚型。提示ESM在关节炎中扮演者抗炎的作用,而BMSM扮演着促炎作用。同时在RA患者滑膜检测ESM、BMSM的比例、炎性因子表达以及极化表型,结果类似于CIA模型。结论:(1)发现SM有胚胎和骨髓两种不同起源。(2)随着小鼠的个体发育,ESM的比例从胚胎期到围产期有下降趋势;从新生期到成年后有上升趋势。而BMSM呈现相反的表达模式。(3)ESM在出生前具有较高的增殖能力,随着个体发育,增殖能力下降。(4)ESM表现出抑制炎症的表型,而BMSM表现出促进炎症的表型。(5)CIA小鼠及RA患者滑膜中ESM极化倾向M2亚型,而BMSM极化倾向M1亚型。并且ESM 比例在病程初始阶段下降至高峰阶段,在缓解期有所升高。而BMSM呈现相反的表达模式。(6)与OA病人的关节滑膜相比,RA病人的关节滑膜中也存在类似ESM及BMSM的不同SM亚型,其中ESM趋向抗炎的表型,而BMSM趋向于促炎的表型。