A型塞内卡病毒（SenecavirusA,SVA）属于小RNA病毒科,塞内卡病毒属。SVA感染是母猪水疱病和新生仔猪急性死亡综合征的病因,引起的临床症状包括病猪口鼻黏膜、蹄部和冠状动脉带等部位出现水疱病变,厌食,跛行以及新生仔猪急性死亡。早期的分离株SVV-001对猪无致病性,因其溶瘤特性一直用于人类癌症治疗的研究。随着时间的推移,越来越多的证据表明SVA感染与猪的特发性水疱病有关。自2015年以来多个养猪大国均暴发了 SVA疫情,70%以上的养猪场遭受了重大经济损失,新生仔猪死亡率达到30%至70%,严重威胁着世界养猪业的健康可持续发展。SVA作为一种新发病原体,对于该病毒的传播途径和致病机制的相关研究还不充分,目前也没有可用的商品化疫苗和有效药物,需要引起高度重视。SVA3C与其他小RNA病毒3C蛋白一样,具有保守的催化盒,主要负责病毒多蛋白的水解和病毒粒子的组装,对病毒的复制至关重要。多聚蛋白的11个切割位点中,有 8 个是由 3C 蛋白负责的,包括 VP2/VP3、VP3/VP1、VP 1/2A、2B/2C、2C/3 A、3 A/3B、3B/3C和3C/3D。此外,3C蛋白在拮抗Ⅰ型干扰素、逃避宿主先天免疫反应以及引起宿主细胞凋亡等方面也发挥着重要的作用。本研究首次制备了 SVA3C蛋白的单克隆抗体,为病毒蛋白的功能研究提供了有力的免疫学工具。通过对3C蛋白氨基酸残基的初步分析,发现3C（H202A）突变体显著降低了诱导细胞凋亡的能力。利用PIV5作为疫苗载体,表达SVAP12A3C蛋白。将重组病毒感染细胞后,观察到SVAP12A3C多肽被正确加工成单个蛋白质,电镜下也观察到SVA的病毒样颗粒（virus like particles,VLP）,为SVA的致病机制和疫苗研发提供了一定的理论基础。1.A型塞内卡病毒3C蛋白单克隆抗体的制备本研究通过原核表达系统表达SVA 3C蛋白,并免疫BALB/c小鼠。然后,利用间接免疫荧光法（IFA）筛选出两株抗3C蛋白的单克隆抗体,12-G9和23-H2。IFA和Western blot结果表明,这两株单抗能够特异性识别SVA 3C蛋白,与其他小RNA病毒无交叉反应。进一步通过血清学实验评估了两株单抗与不同SVA毒株的反应性。结果显示,两株单抗均能识别7株SVA毒株。SVA3C蛋白单克隆抗体的成功制备,为病毒蛋白的结构和功能研究以及新型诊断试剂的开发提供了有力的工具。2.3C蛋白的自剪切活性和诱导细胞凋亡的研究SVA3C蛋白酶在病毒感染后期诱导细胞凋亡,并切割宿主细胞蛋白质,具有细胞毒性。为了得到毒性较小的SVA3C蛋白酶突变体,本研究对3C基因中的部分氨基酸进行了定点突变。通过对突变感染性克隆质粒进行病毒拯救,发现H48、H78、H178、C160、L85、L100、L132和L148这些位点对病毒的复制至关重要,突变后不能成功拯救病毒。真核质粒转染的Western blot结果表明,L105P、L148P、H202A三个突变体在保留3C蛋白酶剪切活性的同时,通过减少细胞凋亡从而增加3C蛋白在宿主细胞中的表达。通过Hoechst染色、Western blot和流式细胞分析,发现这三个突变体均不同程度的降低了 3C蛋白诱导的细胞凋亡。其中,3C（H202A）突变体最显著降低对宿主细胞的凋亡。以上这些研究结果为SVA的致病机制、疫苗研发以及病毒蛋白的功能研究提供了理论参考。3.3C蛋白在病毒样颗粒疫苗中的应用本研究构建了表达SVA衣壳蛋白多肽P1和3C蛋白酶基因的重组PIV5感染性克隆质粒,并进行病毒拯救。IFA结果显示,成功获得了两种重组PIV5病毒,rPIV5-SVA-P12A3C（wt）和 rPIV5-SVA-P12A3C（H202A）。Western blot 结果表明,在重组病毒感染的细胞样品中检测到单个的SVA VP3和3C蛋白,提示着可能发生了 VLP的组装。透射电镜结果显示,形成了 25-30nm大小的SVA VLP。本研究验证了 PIV5作为SVA VLP疫苗载体的可行性,为SVA新型疫苗的研发提供新策略。