【摘 要】
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碱基编辑器（Base editor,BE）是具有突破性的基因编辑技术,它广泛应用于单基因疾病模型的构建以及纠正致病性位点突变。Cpf1蛋白可以识别富含T的原间隔序列邻近基序（Protospacer adjacent motif,PAM）,而Cas9识别富含G的PAM,Cpf1拓宽了靶向的基因组范围。鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）缺乏症是一种X连锁疾病,其发病率占尿素循环相关的遗传性疾病的近一半。OTC
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碱基编辑器（Base editor,BE）是具有突破性的基因编辑技术,它广泛应用于单基因疾病模型的构建以及纠正致病性位点突变。Cpf1蛋白可以识别富含T的原间隔序列邻近基序（Protospacer adjacent motif,PAM）,而Cas9识别富含G的PAM,Cpf1拓宽了靶向的基因组范围。鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）缺乏症是一种X连锁疾病,其发病率占尿素循环相关的遗传性疾病的近一半。OTC是尿素循环途径中常见的酶之一,若该基因发生突变,氨会积聚在血液中,损害神经系统及肝脏。家兔中OTC基因发生突变后,血氨水平会升高,肝脏会呈现纤维化表型,可以模拟人类疾病症状。已有研究报道,dLb Cpf1-BEs在内源位点中平均编辑效率仅为22%,低于传统的n Cas9-BEs（BE4max的编辑效率在69-77%之间）,严重阻碍了dLb Cpf1-BEs的广泛应用,因此通过两种优化方式提高dLb Cpf1-BEs的碱基编辑效率,之后选用效率最高的d Cpf1-e CDA1在家兔胚胎中进行验证并构建OTC基因编辑家兔。1)通过crRNAt RNA、cr-HDV和U-rich crRNA三种修饰方式进行优化,并且在六个不同位点上进行了效率验证。结果显示,U-rich crRNA在所有位点的编辑效率都有轻微提高（1.05倍到1.69倍）;cr-HDV仅将FANCF位点的编辑效率提升了1.85倍,其它五个位点中有两个位点编辑效率反而下降;对于crRNAt RNA而言,六个位点中只有CDKN2A位点编辑效率轻微提升。以上结果揭示,针对crRNAs 3’端的优化不能显著提高d Cpf1-BE3的碱基编辑效率。2)我们进一步推测dLb Cpf1-BE3中使用的大鼠胞嘧啶脱氨酶（r A1）的活性低是影响编辑效率的主要原因,于是选择了三种具有更高活性的脱氨酶（evo APOBEC1、evo CDA1和A3A）分别替换dLb Cpf1-BE3中的r A1,构建了三个BEs系统:d Cpf1-e A1、d Cpf1-e CDA1和d Cpf1-A3A。在HEK293T细胞水平测试了d Cpf1-e A1、d Cpf1-e CDA1、d Cpf1-A3A及dLb Cpf1-BE3的碱基编辑效率,与dLb Cpf1-BE3相比,d Cpf1-e CDA1显著提升了66.7%的位点的碱基编辑效率。而d Cpf1-e A1和d Cpf1-A3A则显著提高了50%的位点的编辑效率。其中,在对富含GC的序列进行编辑时,d Cpf1-e CDA1可显著提高C-T的效率（3.17±0.80%VS 17.38±2.69%）,d Cpf1-A3A虽有所提高但是不显著。总之,d Cpf1-e CDA1系统的编辑效率提高最显著。3)在家兔胚胎的六个位点上对dLbCpf1-eCDA1和dLb Cpf1-BE3系统进行比较,在TYR-1位点中,dLbCpf1-eCDA1的编辑效率为11.75%,dLb Cpf1-BE3的编辑效率为3.67%。除此位点外,dLbCpf1-eCDA1在其它的五个位点上碱基编辑效率均大于30%,最高可以达到77.67%。总之,dLbCpf1-eCDA1的编辑效率在11.75-77.67%之间,而dLb Cpf1-BE3的编辑效率在0-21.7%之间,揭示dLbCpf1-eCDA1可在胚胎水平显著提高碱基编辑效率。4)我们将dLbCpf1-eCDA1应用于对家兔的基因编辑,通过靶向OTC基因的第五外显子,引入提前终止密码子,其编辑效率在7.15%-65.4%之间。进一步通过RT-q PCR及western blotting证实基因编辑兔中OTC的表达量显著降低。综上所述,本研究通过优化替换脱氨酶,开发出编辑效率高的dLbCpf1-eCDA1系统,并应用这一系统构建了OTC基因突变家兔。
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