研究背景Autophagy是细胞的一种能动过程,它表现在细胞浆中出现大量包裹着蛋白质和细胞器的膜性空泡结构和溶酶体对空泡内成分的降解而转变成为机体所需要的能量物质。在进化过程中高度保守,从酵母、果蝇到脊椎动物和人都可以找到参与autophagy的同源基因细胞。在形态学上,即将发生autophagy的细胞胞浆中出现大量游离的膜性结构,称为前自噬泡(Preautophagosome)。前自噬泡逐渐发展,成为由双层膜结构形成的空泡,其中包裹着变性坏死的细胞器和部分细胞浆,这种双层膜被称为自噬泡(Autophagosome)。自噬泡的外膜与溶酶体膜融合,内膜及其包裹的物质进入溶酶体腔,被溶酶体中的酶水解。此过程使进入溶酶体中的物质分解为其组成成分(如蛋白质分解为氨基酸,核酸分解为核苷酸),并被细胞再利用,这种吞噬了细胞内成分的溶酶体被称为自噬溶酶体(Autophagolysosome or Autolysosome)。自噬除了降解蛋白质和细胞器产生能量物质外,还参与机体的许多生理及病理生理变化。当细胞处于饥饿、病原体感染等应激条件时,细胞通过自噬而适应微环境的变化得以适应,生存或自噬性死亡。越来越多的证据表明,细胞自噬与癌症的发生,发展,转归密切相关。当细胞发生恶性转化时,内环境的稳态遭到破坏,其合成代谢速率明显大于分解代谢速率。随着肿瘤进展阶段的不同,Autophagy所扮演的角色发生了很大变化。在癌症发生早期,Autophagy可清除受损或突变的DNA导致癌前细胞的抑制,此时Autophagy发挥的是肿瘤抑制作用。与正常的组织细胞比较,肿瘤细胞的蛋白溶解素及自噬性降解水平均减少。当肿瘤细胞持续分裂增值,癌症呈进展阶段时,癌细胞利用自噬机制对抗营养缺乏和缺氧,这在处于实体肿瘤内部血供不良的癌细胞中尤其明显,此时Autophagy发挥的是促进肿瘤细胞生长存活的作用。Beclin 1是酵母ATG6/Vps30基因在哺乳动物中的同源物,通过与ClassIIIP13K形成复合物参与自噬体的形成。Beclin 1是调节自噬现象的关键蛋白质,是启动自噬过程的标志。人类Beclin1基因位于染色体17q21上,已观察到75%卵巢癌、50%乳腺癌以及40%前列腺癌细胞中存在等位基因的缺失性突变。许多乳腺癌细胞株也表现为等位基因的缺失性突变,而且乳腺癌组织Beclin1蛋白表达水平较周围正常乳腺组织低。在人乳腺癌细胞株MCF-7中Beclin 1蛋白表达水平几乎检测不到,Beclin1转染人乳腺癌细胞株MCF-7后抑制MCF-7细胞在体外增殖,并且在裸鼠中肿瘤的形成受到抑制。和传统的抑癌基因不同,Beclin 1基因只有在双等位染色体都表达时才能发挥抑癌作用。Beclin 1-/的小鼠因没有Beclin 1的表达而死于胚胎早期。Beclin 1+/的小鼠组织细胞表现过度增殖,肿瘤前期病变,虽然表型正常,但细胞自噬活性降低,肿瘤发生率增高,这些都提示了Beclin 1的抑制肿瘤作用。由此可见Beclin 1是参与自噬调控的重要基因,肿瘤细胞自噬性减低是部分实体瘤发生的重要因素。LC3是酵母ATG8基因在哺乳动物中的同源物,在哺乳动物autophagy的自噬泡形成过程中,由Atg3, Atg5, Atg7, Atg10, Atg12和LC3 (Microtubuie-associated protein 1 light chain 3, MAP1-LC3)参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程：Atg12-结合过程和LC3修饰过程起着至关重要的作用13。Atgl2-结合过程与前自噬泡(Preautophagosome)的形成相关,而LC3修饰过程对自噬泡(Autophagosome)的形成必不可少。LC3存在两种形式,LC3-I及LC3-11分子量分别为18、16kd。LC3-Ⅰ存在细胞浆而LC3-Ⅱ存在细胞膜表面。Atg12首先由E1样酶Atg7活化,之后转运至E2样酶Atg10,最后与Atg5结合,形成自噬体前体(Autophagosomal precursor)。LC3前体(ProLC3LC3-ILC3-Ⅰ形成后,首先加工成胞浆可溶性形式LC3-Ⅰ,并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。同样,LC3-1也被Atg7活化,转运至第二种E2样酶Atg3,并被修饰成膜结合形式LC3-Ⅱ. LC3-Ⅱ定位于前自噬体和自噬体,使之成为自噬体的标志分子。一旦自噬体与溶酶体融合,自噬体内的LC3-Ⅱ即被溶酶体中的水解酶降解。哺乳动物细胞内源性Atg5和Atg12主要以结合形式存在；而胞浆可溶性LC3-Ⅰ和膜结合型LC3-Ⅱ的比例在不同组织和细胞类型变化很大。Atg5复合物与自噬泡膜的结合还促进了LC3向自噬泡的募集。Atg5复合物在膜上的定位决定膜的弯曲方向,膜向着背对Atg5复合物的方向延伸。当双层膜结构的自噬泡即将形成环状闭合结构或刚刚闭合时,Atg5复合物便从膜上脱离下来,只留下膜结合形式的LC3-Ⅱ定位于自噬泡膜上。因此,LC3-Ⅱ含量的多少与自噬泡数量的多少成正比。当哺乳动物细胞发生autophagy时,细胞内LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化均明显增加。因此,通过检测细胞内LC3-Ⅱ的含量变化,可以方便地判断细胞状态,判断其autophagy是被诱导还是被抑制。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是临床上最为常见的甲状腺恶性肿瘤,约占甲状腺癌总数的80%以上,常发生于中青年女性,且易发生颈淋巴结转移,约70%的甲状腺乳头状癌患者发病时即合并区域淋巴结转移。而对于高危甲状腺乳头状癌患者,实施颈淋巴结清扫术后,其局部淋巴结复发率为33%,对于低危患者局部淋巴结复发率仍为11%,因此揭示甲状腺乳头状癌的发生及转移机制,防止颈部淋巴结复发具有重要的临床意义。为此我们探讨细胞自噬在甲状腺乳头状癌的发生,发展及转移中的作用。方法(1)采用免疫组织化学染色的方法检测86例新鲜甲状腺乳头状癌组织、癌周正常甲状腺纽织、远处(距肿瘤3cm)正常甲状腺组织临床标本中的Beclin 1及LC3表达,分析Beclin 1、LC3表达水平与甲状腺癌的发生关系。(2)采用免疫组织化学染色的方法检测57例新鲜甲状腺乳头状癌转移淋巴结、正常淋巴结临床标本中的Beclin 1及LC3表达,分析Beclin 1、LC3表达水平与转移淋巴结及正常淋巴结之间的关系,分析Beclin 1、LC3与甲状腺乳头状癌淋巴转移的关系。(3) Western blot分析：检测86例新鲜甲状腺乳头状癌组织、癌周正常甲状腺组织、远处(距肿瘤3cm)正常甲状腺组织临床标本中的Beclin 1及LC3蛋白表达,57例新鲜甲状腺乳头状癌转移淋巴结、正常淋巴结临床标本中的Beclin 1、LC3蛋白表达,分析Beclin 1、LC3蛋白表达水平与肿瘤及正常甲状腺组织及之间、转移淋巴结及正常淋巴结的关系。(4) Beclin 1、LC3表达与淋巴结转移的关系：Fisher’s检验探讨Beclin 1表达与各临床病理因素之间的关系。并应用Logistic多因素回归分析判定影响甲状腺乳头状癌淋巴结转移潜能的独立相关危险因素。结果(1) Beclin 1在甲状腺组织中的表达：免疫组织化学染色显示Beclin 1阳性表达见于细胞浆,强阳性时细胞膜和细胞核亦见表达。甲状腺乳头状癌组织、癌周正常甲状腺组织及远处正常甲状腺组织表达逐渐下降。甲状腺乳头状癌组织Beclin 1的表达为强阳性,表达率为88.4%,癌周正常甲状腺组织及远处正常甲状腺组织为弱表达或阴性表达。每组组织标本均为自身对照。蛋白免疫印迹检测甲状腺乳头状癌组织、癌周正常甲状腺组织及远处正常甲状腺组织均表达Beclin 1,且甲状腺乳头状癌组织表达最强；癌周正常甲状腺组织表达高于远处正常甲状腺组织。(2) Beclin 1在淋巴结组织中的表达：免疫组织化学染色显示Beclin 1强阳性表达见于转移淋巴结,表达率为98.2%,正常淋巴结组织为弱表达或阴性表达。每组组织标本均为自身对照。蛋白免疫印迹检测转移淋巴结及正常淋巴结均表达Beclin 1,且转移淋巴结表达明显高于正常淋巴结。(3) Beclin 1蛋白表达与甲状腺乳头状癌临床病理因素的关系。Beclin 1与临床病理参数包括年龄、性别、肿瘤病理分型、肿瘤大小、肿瘤位置及肿瘤是否侵及甲状腺被膜无相关性。而与淋巴结转移呈正相关,P=0.018。应用Logistic多因素回归分析判定Beclin 1表达是影响甲状腺乳头状癌淋巴结转移潜能的相关危险因素。结论(1)细胞自噬在肿瘤的发生、发展及淋巴结转移中发挥作用。细胞自噬具有双重作用,在肿瘤发生前抑制肿瘤的生长,这在卵巢癌及前列腺癌中得到证实,但在肿瘤进展期时,尤其肿瘤生长迅速时,肿瘤中央区缺血、缺氧,细胞自噬为肿瘤的生长提供能量,使肿瘤细胞得以生存。但在本组的实验研究中,Beclin 1在甲状腺乳头状癌组织中较癌周及远处正常甲状腺组织表达增强,提示细胞自噬增强与甲状腺乳头状癌发生相关。(2) Beclin 1在甲状腺乳头状癌转移淋巴结中表达增强,在正常淋巴结中表达减弱,提示细胞自噬增强与甲状腺乳头状癌淋巴转移相关。Logistic多因素回归分析判定Beclin 1表达是影响甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的相关危险因素。(3)细胞自噬与甲状腺乳头状癌发生及进展相关,细胞自噬抑制剂是否可成为一个新的治疗靶点,尤其防止甲状腺乳头状癌术后颈部淋巴结复发将进一步深入研究。