【摘 要】
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目的探究IGF2信号在结直肠癌中的作用及其对肿瘤免疫应答的影响,为IGF2成为结直肠癌临床治疗的可能靶点提供参考和理论依据。方法1、免疫组化染色+数据库分析自上海芯超生物技术公司购入HCol A180Su17组织芯片,包括101例人结直肠癌样本和79例癌旁样本,交付公司通过免疫组化技术单染IGF2,由两位病理专家进行双盲判读,分析结直肠癌患者中的IGF2表达水平,并通过数据库分析结直肠癌患者IGF
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目的探究IGF2信号在结直肠癌中的作用及其对肿瘤免疫应答的影响,为IGF2成为结直肠癌临床治疗的可能靶点提供参考和理论依据。方法1、免疫组化染色+数据库分析自上海芯超生物技术公司购入HCol A180Su17组织芯片,包括101例人结直肠癌样本和79例癌旁样本,交付公司通过免疫组化技术单染IGF2,由两位病理专家进行双盲判读,分析结直肠癌患者中的IGF2表达水平,并通过数据库分析结直肠癌患者IGF2表达水平与总生存率之间的关系。2、皮下移植瘤动物模型+流式细胞术利用慢病毒构建CT26-IGF2和MC38-IGF2过表达稳转细胞系,并建立相应对照慢病毒CT26-CON,MC38-CON细胞系,通过实时荧光定量PCR（q-RT-PCR）及酶联免疫吸附实验（ELISA）技术验证其过表达。后经皮下荷瘤建立动物模型,通过观察肿瘤大小,建立肿瘤生长曲线;并在荷瘤第13天或15天运用流式细胞术检测肿瘤组织中CD3+、CD4+、CD8+T细胞在肿瘤组织中的浸润比例和功能分子IFN-γ和TNF-α的表达,以及抑制性细胞MDSC、Treg和TAMs的浸润和免疫检查点PD-L1的表达。3、重组小鼠IGF2蛋白处理肿瘤细胞体外培养肿瘤细胞MC38,以重组小鼠IGF2蛋白质刺激肿瘤细胞,采用实时荧光定量PCR和western blot检测肿瘤细胞上PD-L1的表达水平。4、重组小鼠IGF2蛋白处理肿瘤细胞的同时进行缺氧培养体外培养肿瘤细胞MC38,以重组小鼠IGF2蛋白质刺激肿瘤细胞的同时在1%氧气浓度下进行缺氧培养,检测PD-L1以及HIF-1α的表达水平。结果1、IGF2在人结直肠癌样本中高表达,且与预后相关组织芯片结果显示,IGF2在人结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。高IGF2表达的结直肠癌患者预后更差。2、IGF2通过抑制抗肿瘤免疫促进结直肠癌的进展CT26-IGF2组肿瘤组织中CD3阳性T细胞、CD8阳性T细胞浸润及CD8阳性T细胞功能因子表达降低。CT26-IGF2组肿瘤细胞上PD-L1表达增加。提示IGF2可通过PD-1/PD-L1通路抑制抗肿瘤免疫促进结直肠癌的进展。3、IGF2协同缺氧上调肿瘤细胞PD-L1的表达水平Western blot和实时荧光定量PCR结果表明,在常氧条件下,IGF2过表达细胞系和重组蛋白处理的野生型肿瘤细胞上PD-L1的表达水平无明显改变。而在缺氧环境中,通过流式和PCR检测分析,发现IGF2重组蛋白刺激后的野生型肿瘤细胞或IGF2过表达细胞系上PD-L1的表达水平上调。4、HIF-1α通路可能参与IGF2驱动的PD-L1表达水平上调在缺氧条件下,重组小鼠IGF2蛋白处理野生型肿瘤细胞的加入同时进行缺氧培养,发现PD-L1的表达水平上调的同时,Ⅰ型缺氧诱导因子（HIF-1α）的表达水平也出现了有统计学差异的上调。结论1、IGF2在结直肠癌样本中高表达,其表达水平与结直肠癌的预后密切相关。IGF2表达高的结直肠癌患者预后更差。2、IGF2通过抑制CD8+T细胞浸润和功能,抑制抗肿瘤免疫应答,促进结直肠癌的进展。3、IGF2协同缺氧上调肿瘤细胞上PD-L1的表达水平。
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