蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage,SAH）是一种较为常见的出血性脑卒中疾病,SAH在大多数情况下是由于动脉瘤破裂造成的。虽然SAH只占脑卒中总病例数的5%左右,但因其高死亡率和高致残率的特点,SAH对个人和社会有重大的影响。随着医疗技术的发展,手术夹闭或栓塞动脉瘤可以有效降低死亡率,改善病人预后。但是手术治疗只能降低其再次出血的风险,SAH对大脑的损伤依然存在。过去认为影响预后的主要原因是迟发性脑血管痉挛,然而针对脑血管痉挛的治疗并未改善SAH患者的预后。这说明还有其他病因影响着SAH预后。早期脑损伤（Early brain injury,EBI）目前得到了越来越多国内外专家的关注,EBI指的是从SAH开始至其72小时这段时间的颅脑损伤。但目前没有针对早期脑损伤治疗的药物。因此探索有效的治疗药物是成为解决该领域问题的主要任务。中药防己具有辛能行散,苦寒降泄的作用。其有效成分粉防己碱已经应用于临床。有研究指出粉防己碱具有神经保护作用,但具体机制尚未完全阐明。自噬是真核细胞对自身受损的蛋白和细胞器降解回收的过程。对维持细胞稳态和能量代谢起到至关重要的作用。自噬受多条信号通路调控,其中AMPK/mTOR信号通路在调控自噬中发挥着重要的作用。SAH后的EBI会上调自噬水平已经被多个研究证实过,但是粉防己碱是否可以通过AMPK-mTOR信号通路调控自噬,是否通过影响自噬水平而发挥对EBI神经保护作用,尚未见报道。SIRT3是属于Sirtuins家族。在脑组织中表达丰富且主要分布于线粒体之中。SIRT3参与了细胞的氧化应激,能量代谢的调节。SIRT3的上调在多种疾病中起到了减轻损伤,改善预后的作用。已经成为减轻氧化应激反应、缺血损伤和炎症反应的研究热点。进一步的研究发现SIRT3可以通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬。但是在SAH中,粉防己碱是否可以通过SIRT3来调控AMPK/mTOR信号通路进而影响自噬尚未可知。因此本实验通过血管内穿刺法制作SAH模型,模拟临床上SAH后的EBI的病理生理学过程,观察粉防己碱是否可以通过SIRT3/AMPK/mTOR信号通路介导自噬减轻SAH后的EBI。第一部分粉防己碱通过调控自噬改善蛛网膜下腔出血后大鼠早期脑损伤的研究。目的:通过蛛网膜下腔出血大鼠动物模型观察粉防己碱对SAH后自噬的影响,探讨粉防己碱是否可以通过调控自噬改善蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤。方法:将300-330g的雄性SD大鼠随机分为三组:假手术组,SAH组,粉防己碱组。三组均采用血管内穿刺法制造SAH模型,除假手术组外,其他两组在感受到血管阻力后刺破血管。假手术组当感受到血管阻力后撤出线栓,避免刺破血管。粉防己碱组于模型制作完成后立即腹腔注射粉防己碱（20mg/kg）。通过SAH出血量评分,评估SAH模型的均一稳定性。通过神经功能评分和脑含水量的测定观察其神经损伤程度。采用TUNEL染色观察各组鼠的脑皮质区细胞凋亡情况。采用尼式染色观察各组大鼠细胞形态和神经细胞的数量。通过Western Blot法检测LC3和p62蛋白的表达水平。结果:1 SAH出血评分:SAH组和粉防己碱组的蛛网膜下腔出血评分明显高于假手术组（P<0.01）。而SAH组和粉防己碱组之间无统计学差异。2脑含水量和神经功能缺陷评分结果的比较::SAH相较于假手术组,神经功能缺陷评分显著下降,脑含水量显著上升（P<0.01）。同时,相较于SAH组,粉防己碱组大鼠的神经功能缺陷评分上升、脑含水量下降（P<0.01）。3细胞凋亡情况:TUNEL染色结果显示,与假手术组相比,SAH组大鼠脑皮质区细胞凋亡率显著升高（P<0.01）;与SAH组比较,粉防己碱组大鼠脑皮质区细胞凋亡率显著降低（P<0.01）。4细胞形态学观察:尼式染色结果显示:假手术组神经细胞形态正常,尼式体丰富。SAH组与假手术组相比损伤严重,并伴随大量神经细胞丢失（P<0.01）。但粉防己碱组与SAH组相比损伤得到明显缓解,且神经细胞数量增多（P<0.01）。5 P62和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达情况:相较于假手术组,SAH组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著升高（P<0.01）,P62的表达水平显著下降（P<0.01）。而与SAH组相比较,粉防己碱组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著降低（P<0.01）而P62的表达水平显著升高（P<0.01）。小结:粉防己碱对SAH后的EBI具有神经保护作用,体现在粉防己碱改善了 SAH介导的神经功能损伤情况和神经细胞形态损伤,减少了脑含水量、神经细胞的凋亡率和神经细胞的损失。同时粉防己碱降低了 SAH后的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平,并升高了 P62蛋白的表达,表明粉防己碱可能通过抑制自噬减轻SAH后的EBI。第二部分 粉防己碱通过SIRT3/AMPK/mTOR信号通路抑制自噬减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的研究目的:通过SAH模型观察粉防己碱对SIRT3/AMPK/mTOR信号通路的影响,探讨粉防己碱是否可以通过SIRT3/AMPK/mTOR信号通路调控自噬发挥对SAH后EBI的神经保护作用。方法:将雄性SD大鼠随机分配为假手术组,SAH组,粉防己碱组,粉防己碱+3-TYP组。在术前对粉防己碱+3-TYP组的大鼠进行预处理,每两天给予大鼠3-TYP（30mg/kg）一次,共三次,然后再进行SAH手术。术后立刻对粉防己碱组和粉防己碱+3-TYP组的大鼠腹腔注射粉防己碱溶液（20mg/kg）。通过SAH出血量评分,评估SAH模型的均一稳定性。通过神经功能评分和脑含水量的测定观察其神经损伤程度。采用HE染色观察各组鼠的脑皮质区神经细胞的形态。采用免疫荧光和Western Blot检测SIRT3在各组中的蛋白表达水平。使用Western Blot检测各组的LC3、p-AMPK、AMPK、p-mTOR及mTOR的蛋白表达水平。结果:1 SAH出血评分:假手术组与SAH组、粉防己碱组和粉防己碱+3-TYP组的评分差距有统计学意义（P<0.01）。而SAH组、粉防己碱组和粉防己碱+3-TYP组之间SAH评分无统计学意义（P>0.05）。2脑含水量和神经功能缺陷评分结果的比较:相较于假手术组,SAH组大鼠的脑含水量明显上升且神经功能缺陷评分明显下降（P<0.01）。但与SAH组相比,粉防己碱组脑含水量显著下降、神经功能缺陷评分显著上升（P<0.01）,与粉防己碱组相比,粉防己碱+3-TYP组脑含水量上升且神经功能缺陷评分下降（P<0.05）。3各组大鼠神经细胞形态比较:HE染色结果显示:假手术组大鼠脑皮质区神经细胞形态正常;SAH组大鼠脑皮质区大量神经细胞出现核固缩,深染现象;粉防己碱组大鼠脑组织的上述情况相较于SAH组显著缓解。与粉防己碱组相比,粉防己碱+3-TYP组神经细胞损伤加重。4 SIRT3在各组大鼠脑组织的表达情况:免疫荧光结果表明:相较于假手术组,SAH组大鼠脑皮质区的SIRT3荧光强度明显减少（P<0.01）。与SAH组相比,粉防己碱组荧光强度明显增加（P<0.01）。与粉防己碱组相比,粉防己碱+3-TYP组荧光强度明显下降（P<0.01）。5 SIRT3蛋白表达情况:Western blot结果显示:与假手术组相比,SAH组SIRT3蛋白表达减少（P<0.05）。与SAH相比,粉防己碱组SIRT3蛋白表达上调（P<0.05）。相较于粉防己碱组,粉防己碱+3-TYP组蛋白表达下降（P<0.05）。6各组大鼠脑组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达情况:Western blot结果显示:与Sham相比,SAH组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显著上升（P<0.01）。与SAH相比,粉防己碱组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显著下降（P<0.01）。相较于粉防己碱组,粉防己碱+3-TYP组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显著上升（P<0.01）。7各组大鼠脑组织p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR的蛋白表达情况:Western blot结果显示:与假手术组相比,SAH组p-AMPK/AMPK的比值显著上升,但p-mTOR/mTOR的比值显著下降（P<0.01）。与SAH组相比,粉防己碱组的p-AMPK/AMPK 比值显著下降,但p-mTOR/mTOR的比值显著上升（P<0.01）。相较于粉防己碱组,粉防己碱+3-TYP组p-AMPK/AMPK的比值显著上升,但p-mTOR/mTOR的比值显著下降（P<0.01）。小结:3-TYP可以部分逆转粉防己碱对SAH后大鼠的神经保护作用。该作用可能与3-TYP抑制了粉防己碱对SAH后大鼠SIRT3蛋白的上调,激活了 AMPK-mTOR信号通路,进而解除了粉防己碱对SAH后大鼠大脑自噬抑制作用有关。表明粉防己碱可通过SIRT3-AMPK-mTOR信号通路抑制自噬发挥对EBI的保护作用。结论:粉防己碱可以对SAH后的EBI发挥神经保护作用,这可能与上调SIRT3蛋白的表达并通过SIRT3-AMPK-mTOR信号通路抑制SAH后脑组织的自噬有关。此外SIRT3可以负向调控AMPK-mTOR信号通路进而影响自噬。