对急性白血病的治疗已取得很大的进展，国内外对儿童急性白血病化学治疗进行了较多的临床探索，化疗方案几经改进，但仍不尽人意。多药耐药(MDR，multi-drug resistance)是造成儿童急性白血病治疗不缓解或缓解后复发的主要因素，对MDR产生机制及克服方法的研究已成为近年来白血病研究的热点。 白血病耐药性是指白血病细胞对化疗药物的不敏感性，它既可以天然存在(内源性耐药)，也可以由抗癌药物诱发(获得性耐药)。多药耐药是其最重要的耐药形式之一，它是白血病细胞接触一种抗肿瘤药物并产生耐药以后，同时对结构和作用机理不同的多种天然来源的抗肿瘤药物具有交叉耐药性。有关MDR的发生机制多年来已作了大量的研究。目前认为它的发生机制是复杂多样的，主要有：1.膜转运蛋白介导MDR：P-糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等。2.酶系统：谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、部分抗癌药物靶酶(如DNA拓扑异构酶Ⅱ)、Pgp磷酸化相关酶磷酸化激酶和细胞氧化和解毒酶系统P1450等。3.与细胞凋亡有关因子及基因：Bcl-2、Bax、Mcl-1、NF-KB和突变p53等。4.其他：DNA损伤修复能力增强；细胞膜的改变影响药物的转运和外排：细胞激素受体量和亲合力的改变等也与肿瘤细胞耐药的发生相关。通常，同一耐药细胞可有几种不同的机制参与耐药形成。 肿瘤生长依赖于血管生成，血管生成也是肿瘤转移所必需的，并且与肿瘤多药耐药密切相关。肿瘤细胞分泌的多种血管生成之间相互联系和调控，其中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管内皮细胞生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)处于整个肿瘤血管生成过程的上游和中心。VEGFR2在VEGF的信号转导及血管内皮生成、迁移、抑凋亡中起主导作用。研究结果表明，多种血液系统肿瘤存在明显的骨髓血管新生现象。白血病细胞分泌的VEGF可以选择性作用于血管内皮上的特异性受体VEGFR2，促进产生新生血管，维持肿瘤新生血管的形成，导致骨髓异常增殖。此外，血液系统肿瘤白血病中存在VEGF的自分泌机制，即白血病细胞分泌的VEGF诱导自身表达VEGFR2，从而维持自身存活、增殖，阻止细胞凋亡，增强血液肿瘤细胞对放化疗抵抗作用，并引起细胞迁移，同时参与白血病细胞MDR的形成。阻断VEGF/VEGFR2信号转导通路可以抑制肿瘤细胞的存活生长，并促进其凋亡明显提高白血病细胞对放化疗的敏感性，从而逆转白血病细胞的耐药。VEGF/VEGFR2可作为白血病治疗的一个理想靶点。 RNA干扰(RNAi)作为一种进化保守的转录后基因沉默机制，是指双链RNA分子(dsRNA)被切割成21～23个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)，最终使其同源的mRNA特异性降解。RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点，随着siRNA在活体中的稳定性和转染效率的提高、非特异性作用的减少，正迅速应用于实验研究临床中。本课题组前期工作郭海霞等成功构建并筛选出有效的VEGFR2siRNA，可特异抑制HL60细胞VEGFR2的表达，从而达到抑制VEGF/VEGFR自分泌链的作用。 基于上述研究，本实验建立HL60/VCR多药耐药细胞系，明确VEGF与传统指标mdr1，MRP，TOPII和GST-π等的关系，探讨VEGF可否作为白血病的耐药指标之一。进而采用RNA干扰技术沉默耐药细胞株的VEGFR2阻断VEGF/VEGFR2信号转导通路预期达到逆转白血病细胞株耐药的目的，为白血病的治疗提供一条新的策略。 第一章HL60/VCR耐药细胞株的建立及其相关耐药机制的研究 目的：探讨白血病细胞产生耐药的机制以及VEGF在白血病细胞产生耐药过程中的作用，明确VEGF与传统指标mdr1，MRP，TOPII和GST-π等的关系，探讨VEGF可否作为白血病的耐药指标之一。 方法：采用反复暴露并逐渐提高诱导药物浓度的方法建立HL60/VCR多药耐药细胞系，MTT法检测细胞的耐药性及交叉耐药性，RT-PCR检测诱导前后mdrl，MRP，GSTπ，TopoII α和VEGF mRNA的表达情况。 结果：VCR诱导后的HL60/VCR不仅对原诱导药物VCR高度耐药，而且对葸环类抗生素和表鬼臼毒素亦具有较高的耐药性，对紫杉醇类轻度耐药。与HL60相比，HL60/VCR的mdrl和VEGF mRNA的表达明显增强，GSTπmRNA和TopoⅡα mRNA的表达无明显变化。HL60和HL60/VCR均不表达MRPmRNA。 结论：成功建立了HL60/VCR多药耐药模型，耐药基因mdrl和VEGF共同参与HL60/VCR多药耐药的形成。VEGF可作为白血病细胞耐药的一个新指标。 第二章VEGFR2siRNA逆转白血病细胞肿瘤耐药的实验研究 目的：根据本课题组前期成功筛选出的有效VEGFR2siRNA，利用siRNA表达载体法，构建质粒pSliencer4.1/shVEGFR2，转染耐药细胞，观察RNAi效果及其对肿瘤耐药的作用。 方法：将VEGFR2siRNA按照载体pSliencer4.1构建的要求，合成VEGFR2shRNA，连接载体，构建质粒pSli encer4.1/shVEGFR2，转染感受态细胞E．col i，大量扩增质粒。利用脂质体技术，将质粒转染HL60/VCR耐药细胞，RT—PCR和western blot检测VEGFR2mRNA和蛋白的表达情况。shVEGFR2沉默HL60/VCR的VEGFR2表达后，利用MTT法检测其对抗肿瘤药物的耐药性和western blot检测Pgp蛋白的表达情况。 结果：质粒pSliencer4.1/shVEGFR2测序结果证实shVEGFR2正确克隆入载体pSl iencer4.1中。将质粒pSl iencer4.1/shVEGFR2转染HL60/VCR耐药细胞，VEGFR2mRNA和蛋白的表达明显减少。shVEGFR2沉默HL60/VCR的VEGFR2表达后，其对抗肿瘤药物的耐药性明显下降，Pgp蛋白的表达下降。 结论：成功构建了质粒pSliencer4.1/shVEGFR2，转染细胞后可特异沉默VEGFR2的表达。shVEGFR2可降低HL60/VCR细胞Pgp蛋白的表达和部分逆转其多药耐药状况。 第三章VEGFR2siRNA对HL60/VCR耐药细胞凋亡的影响 目的：观察探讨VEGFR2siRNA对白血病细胞凋亡的影响，探讨VEGFR2siRNA对HL60/VCR细胞耐药逆转的机理。 方法：将质粒pSliencer4.1/shVEGFR2转染HL60/VCR耐药细胞后，换成原维持培养基培养，检测其线粒体膜电位和细胞凋亡情况。取pSliencer4.1/shVEGFR2转染后的HL60/VCR细胞，流式细胞仪检测其Bcl-2家族的表达情况和western blot检测Mcl-1的表达情况。 结果：1.pSlencer4.1/shVEGFR：转染HL60/VCR细胞24h后，换成原维持培养基培养，其线粒体膜电位降低，但早期诱导凋亡作用不明显，当作用时间达48h以上其诱导细胞凋亡的作用增强。2.pSlencer4.1/shVEGFR2转染HL60/VCR细胞可明显降低HL60/VCR的Bcl-2的表达和Mcl-1的表达，对Bcl-x1、Bax的表达无明显变化。 结论：pSlencer4.1/shVEGFR2可通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、 Mcl-1的表达，降低线粒体膜电位电位，促进HL60/VCR发生凋亡，逆转其多药耐药。