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目的良性前列腺增生症(BPH)是老年泌尿外科常见病之一,可引起复杂的下尿路症状,危害老年男性的健康。随着社会经济的发展,人口老龄化,其患病率呈迅速上升趋势。其治疗方法包括药物治疗和手术治疗。目前临床使用的药物包括α肾上腺能受体拮抗剂及5α还原酶抑制剂,疗效并非十分满意。手术疗法是一种有效的治疗手段,但有一定的创伤和并发症。因此,有必要寻找新的安全、有效、经济的治疗方法。前列腺组织主要由间质和腺体两种成分组成,BPH组织内间质与上皮的比例由正常的2：1增加至5：1。与上皮增生相对而言,间质增生程度更为显著。而且,BPH的发生也是从间质的增生开始的。间质内可见大量功能旺盛的平滑肌肌细胞和成堆聚集的成纤维细胞。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)广泛分布在心、脑、肝、肾等人体组织中。它是一种强的有丝分裂原,能够促进多种细胞的增殖分化、迁移和血管生成,在某些异常增生和肿瘤组织中有较高水平的表达。抑制或阻断bFGF(或其受体),可以抑制多种细胞的增殖,促进凋亡,有些已开始临床试验。研究表明,bFGF在良性前列腺增生(BPH)组织中表达明显增加,通过自分泌和旁分泌的方式,促进前列腺细胞的增殖、分化,在良性前列腺增生症的发病中具有重要作用。本研究进一步明确前列腺上皮和间质中bFGF表达的相对水平。RNA干扰(RNA interference, RNAi),是双链RNA引发同源mRNA特异性降解,在转录后水平关闭靶基因表达的现象。这一基因阻断技术特异性强、效率高,在基因功能研究、基因治疗方面显示出巨大的前景。腺病毒载体由于具有感染效率高,宿主细胞范围广和转染效果稳定等优势,是最常应用的基因转移工具。构建bFGF特异的RNAi腺病毒表达载体,阻断bFGF在细胞、组织中的表达,能够为多种增生性疾病提供有效的研究工具。我们采用的Adeno-XTM Expression Systems 2,构建bFGF特异的shRNA腺病毒表达载体,感染体外培养的前列腺间质细胞,观察其对前列腺间质细胞bFGF表达以及细胞增殖、凋亡的影响。方法应用免疫组织化学方法检测正常成人和良性增生前列腺组织的上皮和间质中bFGF蛋白的表达水平,采用纤维图像数据处理系统进行显微图像分析,每张切片随机选择5个视野,测定整体以及上皮和间质区域bFGF染色的平均光密度值。构建bFGF shRNA腺病毒表达载体,主要分为3步：(1)合成针对bFGF(GenBank accession number NM002006.4)CDS的19nt(800～818位碱基)的shRNA寡核苷酸片段,退火成双链后与线性化的Donor质粒pSHREN-DNR连接,成为表达bFGF shRNA的重组Donor质粒pSHREN-DNR-sh-bFGF, PCR及测序鉴定；(2)Donor质粒pSHREN-DNR-sh-bFGF和Acceptor质粒pLP-Adeno-X-PRLS重组,形成含bFGF shRNA表达盒和5型腺病毒基因组(△E1／△E3)并具有Cm抗性的重组腺病毒质粒pAd5-sh-bFGF。(3)在HEK393细胞中包装、扩增腺病毒：将pAd5-sh-bFGF用Pacl线性化,转染HEK293细胞,包装出腺病毒感染颗粒Ad5-sh-bFGF并扩增。同时构建无意义对照病毒Ad5-sh-Non。测定病毒滴度。体外培养人前列腺间质细胞。分别以MOI=0.1、1、10、100的Ad5-sh-bFGF、Ad5-sh-Non、Ad5-EGFP(表达EGFP的5型复制缺陷型腺病毒)感染接种于96孔板中的前列腺间质细胞(复孔数为10),并设无病毒感染的对照,分别于感染1～6天,MTT法测定细胞增殖情况,计算细胞增殖抑制率=(1-实验组A值／对照组A值)×100%。6孔细胞培养板每孔接种5×10。前列腺间质细胞,以MOI=10的重组腺病毒Ad5-sh-bFGF、Ad5-sh-Non、Ad5-EGFP感染,并设无病毒感染的空白对照,每组12个复孔,根据MTT实验测得的最适感染复数和效应时间,流式细胞仪AnnexinV-PI双染色法检测细胞凋亡水平,荧光定量PCR检测Ad5-sh-bFGF感染后体外培养前列腺间质细胞bFGF mRNA表达水平,Western blotting检测bFGF蛋白表达水平。结果与正常前列腺相比,良性前列腺增生组织中,bFGF的表达水平升高,差异显著(P<0.01)。间质bFGF的表达水平明显高于上皮组织(P<0.01),间质中bFGF表达量的增加亦远高于上皮组织。成功构建了bFGF特异的RNAi腺病毒表达载体Ad5-sh-bFGF,可供后续实验使用。Ad5-sh-bFGF感染体外培养前列腺间质细胞3天后,MOI=0.1、1、10、100时细胞增殖抑制率分别为5.68%、8.57%、12.63%和14.93%,感染复数为10时,细胞增殖抑制率高于0.1和1组,差异显著(P<0.01),与MOI=100组无显著性差异(P>0.05)。MOI=10时感染效率接近100%。用MOI=10的Ad5-sh-bFGF、Ad5-sh-Non、Ad5-EGFP感染前列腺间质细胞3天后,增殖抑制率分别为12.63%、4.93%和4.08%,Ad5-sh-bFGF组与其他两组比较差异有统计学意义(P<0.01),而后两组无明显差异(P>0.05)。体外培养前列腺间质细胞感染重组腺病毒Ad5-sh-bFGF 72小时后,细胞凋亡率为10.51±1.66%,明显低于Ad5-sh-Non感染组、Ad5-EGFP感染组和空白对照组,差异显著(P<0.01)。荧光定量PCR检测重组腺病毒Ad5-sh-bFGF感染72小时后,体外培养前列腺间质细胞bFGF mRNA相对表达量(bFGF/β-actin)为0.431±0.097,明显低于Ad5-sh-Non感染组、Ad5-EGFP感染组和空白对照组,差异显著(P<0.01),而后三组间无显著性差异(P>0.05)Western Blot检测重组腺病毒Ad5-sh-bFGF感染72小时后,体外培养前列腺间质细胞bFGF蛋白的相对表达量(bFGF/β-actin)为0.260±0.062,与空白对照组、Ad5-EGFP感染组和Ad5-sh-Non感染组相比,差异显著(P<0.01),而后三组间无显著性差异(P>0.05)结论与正常前列腺相比,良性前列腺增生组织中,bFGF的表达水平明显升高。间质bFGF的表达水平明显高于上皮组织,且间质中bFGF表达量的增加亦远高于上皮组织。成功构建了bFGF特异的RNAi腺病毒表达载体Ad5-sh-bFGF,感染体外培养前列腺间质细胞后,能够抑制其增殖,促进其凋亡,这些作用与其抑制了细胞bFGF的表达有关。