第一部分血清降钙素原应用于心脏术后呼吸机相关性肺炎诊断及预后的临床研究目的：观察心脏术后早发型呼吸机相关性肺炎(Ventilator-associated pneumonia, VAP)患者血清降钙素原(Procalcitonin, PCT)、胰石蛋白(Pancreatic stone protein, PSP)、白介素6(Interleukin-6, IL-6)、C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)的动力学改变,评价这些指标在VAP中的诊断及预后价值,为临床上准确诊断及评估VAP患者提供参考。方法2012年2月至2012年12月期间在中南大学湘雅二医院心胸外科重症加强护理病房(Intensive care unit, ICU)接受机械通气大于48小时的心脏术后成年患者51例,根据机械通气4天内是否诊断为VAP分为VAP组(n=33)及非VAP组(n=18),对VAP组患者随访28天,根据患者是否死亡进一步分为存活组26例和死亡组7例。所有患者术前、VAP组患者在临床诊断VAP当天(非VAP组患者在拔管当天,定义为第一天)之后的1周内隔日抽取静脉血4次进行血清PCT、PSP、IL-6及CRP测定。其中PCT、IL-6采用电化学发光法检测,CRP采用乳胶免疫比浊法检测,PSP采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测。记录各组患者的一般、围手术期情况及术后非感染性并发症等资料,并统计所有患者第一天、第七天序贯器官衰竭估计(Sequential organ failure assessment, SOFA)评分和下呼吸道分泌物病原学培养阳性结果。两组间比较采用Student t检验、Mann-Whitney检验或卡方检验。采用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve, ROC曲线)评价各指标对VAP诊断及预后的检验效能。Spearman秩相关分析方法计算两变量之间的关系。结果VAP组患者机械通气时间、ICU住院时间、第一天及第七天的SOFA评分显著高于非VAP组,死亡组患者的第一天及第七天的SOFA计分也明显高于存活组,差异均具有统计字意义。其他围手术期情况和术后非感染性并发症等在各组患者间无统计学差异。所有患者术后血清PCT、IL-6、CRP及PSP均较术前显著升高。心脏术后发生VAP的患者第一天血清PCT显著高于非VAP患者,诊断VAP的ROC曲线下面积为0.886(P值=0.00),第一天血清PCT≥5.0ng/ml诊断VAP敏感性及特异性可分别达到93.9%及83.3%,而血清IL-6、CRP及PSP对VAP均无诊断价值；在发生VAP的患者中,第五天及第七天PCT水平、第七天CRP及PSP水平、第一天及第七天SOFA评分对患者死亡均有一定预测价值,其中以第七天血清PCT预测价值最佳,ROC曲线下面积为0.869(P值=0.01),以6.4ng/ml为截断值,PCT对预测VAP患者死亡敏感性为80.0%,特异性可达96.2%。第一天及第七天SOFA评分预测VAP死亡的ROC曲线下分别为0.805及0.865(P值<0.05),第一天SOFA评分≥14分和第七天SOFA评分≥9分的敏感性及特异性分别为57.1%、80.0%及92.3%、84.6%。第七天血清PSP和CRP预测VAP死亡的ROC曲线下面积分别为0.808和0.831(P值<0.05),第七天血清PSP≥494ng/ml及血清CRP≥87ng/ml预测VAP患者死亡的敏感性和特异性分别为80.0%、80.0%和80.8%、73.1%。血清PCT水平与SOFA评分呈显著的直线正相关(第一天及第七天血清PCT和SOFA评分的Pearson积差相关系数(Pearson’s r,r)分别为0.54及0.66,P值<0.01)。33例确诊VAP患者下呼吸道分泌物培养分离出革兰阴性杆菌37株,占82%,革兰阳性球菌5株,占11%,真菌3株,占7%。结论1.经历体外循环的心脏手术对血清PCT、PSP、IL-6及CRP水平均产生影响,术后并发症能够使血清PCT、PSP、IL-6及CRP显著上升；2.PCT对诊断心脏术后早发型VAP有重要参考价值,而IL-6、CRP及PSP对VAP均无诊断价值；3.连续监测血清PCT、PSP及CRP动力学变化对有助于预测VAP患者的预后,在病程的不同时期内,SOFA评分及血清PCT、CRP及PSP水平均对VAP患者的死亡均有一定预测价值,其中以血清PCT的敏感性及特异性最高,是预测VAP患者预后的良好指标；4.血清PCT与SOFA评分存在显著正相关,能够反映出患者的病情危重情况,其水平越高,病情越重；5.VAP病原学以革兰阴性杆菌为主,血清PCT、PSP、IL-6及CRP无助于革兰阳性菌及革兰阴性菌的鉴别。第二部分Th17/Treg细胞在心脏术后呼吸机相关性肺炎中表达及作用的初步研究目的研究心脏术后全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)及呼吸机相关性肺炎(Ventilator-associated pneumonia, VAP)中辅助性T细胞17(Thelper17cell, Th17细胞)和调节性T细胞(RegulatoryT cell, Treg细胞)特异性转录因子维甲酸相关孤儿核受体(Retinoid-related orphan nuclear receptor-γt, ROR-yt)和叉头翼状螺旋转录因子3(Forkhead transcription factor3, Foxp3)及相关细胞因子IL-17和IL-10、IL-6mRNA.蛋白水平的表达情况,以及各指标与血清PCT水平的关系,初步探讨Th17/Treg细胞在心脏术后SIRS及VAP早期阶段中的作用机制,为揭示Th17/Treg细胞平衡调节机制在VAP发病及治疗中提供一种理论和实验依据。方法2012年2月至2012年12月期间在中南大学湘雅二医院心胸外科重症加强护理病房(Intensive care unit, ICU) J心脏术后接受机械通气大于48小时的SIRS患者8例及VAP患者8例,另选取正常健康人8例,采用密度梯度离心法分离外周血单个核淋巴细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC),采用RNA提取试剂盒提取PBMC中总RNA,分光光度计测定总RNA浓度,琼脂糖凝胶电泳检验提取的总RNA质量。采用实时定量逆转录聚合酶链反应技术(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)测定PBMC中Th17细胞和Treg细胞特异性转录因子ROR-yt和Foxp3及相关细胞因子IL-17和IL-10、IL-6mRNA的表达情况。测定血清IL-17、IL-10、IL-6及PCT水平,其中IL-17、IL-10采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测,PCT、IL-6采用电化学发光法检测。mRNA的计算采用-△CT相对定量法。两组间比较采用Student t检验或Mann-Whitney检验。Spearman秩相关分析方法计算各检测指标与血清PCT之间的关系。结果抽提的PBMC中总RNAOD26onm/OD280nm比值均在1.8-2.0之间,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测显示清晰的三条分别为28S、18S、5s的条带,其中18s与28s RNA荧光强度比值约为1：2。所有实时定量PCR熔解曲线图上均只有一个峰值。VAP组、SIRS组患者的IL-17、IL-10、IL-6、Foxp3及ROR-yt的mRNA水平均较正常对照组升高,差异有统计学意义,VAP组患者的IL-10、Foxp3的mRNA水平显著高于SIRS组(P值<0.05),而IL-17、IL-6及ROR-yt的mRNA水平在VAP组及SIRS组间无统计学差异。VAP组、SIRS组患者的血清IL-17、IL-10及IL-6水平均显著高于正常对照组,差异有统计学意义。VAP组患者血清IL-10水平也显著高于SIRS组,但血清IL-17及IL-6水平在SIRS组及VAP组间无统计学差异。Foxp3、血清IL-10水平与血清PCT水平存在直线正相关,其Pearson积差相关系数(Pearson’s r, r)分别为0.53及0.64(P值<0.05)。结论1.Thl7细胞参与心脏术后SIRS的发生,在VAP发病早期的作用仍需进一步探讨；2.Treg细胞在心脏术后活化并对抗SIRS诱发的炎症反应,Treg细胞介导的抗炎反应在VAP诊断初期已经发生,并在VAP患者体内紊乱的免疫调节功能中发挥着一定作用；3.血清PCT与Treg细胞特异性转录因子ROR-yt及血清IL-10水平存在正相关,能够在一定程度上反映患者体内的抗炎反应活化程度。