鸡γ干扰素(Chicken interferon-gamma, ChIFN-γ)具有较强的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用,作为生物药剂和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。正常情况下,机体产生IFN-γ的数量很有限,一定程度上限制了IFN-γ的应用。本实验主要采用重组DNA和基因表达技术,通过RT-PCR方法成功克隆鸡IFN-γ基因,并对其基因序列进行了分析,旨在为大量制备和生产高效廉价的鸡IFN-γ及其体外大量表达作好准备。在体外鸡IFN-γ生物学活性研究基础上,联合禽流感灭活疫苗免疫研究机体的免疫应答反应,对鸡IFN-γ的免疫增强作用进行了研究。根据GenBank发表的ChIFN-γ基因序列,设计了一对引物,采用RT-PCR方法,从激活的脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出ChIFN-γ基因序列。琼脂糖凝胶电泳显示扩增出的片段约为495 bp。经过双酶切、PCR鉴定和测序结果显示,克隆的ChIFN-γ基因与GenBank发表的鸡IFN-γ基因序列同源性为99.8%。将扩增的ChIFN-γ克隆至原核表达载体pET30a上,构建了重组表达质粒pET-30a-ChIFN-γ。将其转入大肠杆菌BL21 (DE3)中,于37℃不同时间诱导表达,经SDS-PAGE分析表明该蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,且以可溶蛋白的形式存在。蛋白通过镍离子亲和树脂进行纯化,并作为免疫原制备兔抗ChIFN-γ多抗血清。Western-blot表明目的蛋白与多抗血清有很好的免疫反应性。在动物免疫试验中设计了4个处理组,即空白组(C组)、对照组(P组)、疫苗组(V组)、佐剂组(N组)。利用血凝抑制实验、淋巴细胞转化试验及流式细胞仪技术对不同日龄雏鸡的各项免疫指标进行了检测,最后进行H5N1亚型禽流感病毒的攻击试验。试验结果表明,接种鸡IFN-γ的佐剂组雏鸡的抗体水平、T和B淋巴细胞增殖反应、CD4+和CD8+、细胞数量、雏鸡增重、免疫器官指数与疫苗组相比都有明显的提高;攻毒后对各试验组禽流感病毒靶器官进行了病理学研究,同时对不同免疫组之间的免疫保护率进行比较,结果进一步证明ChIFN-γ能够很好地提高机体的免疫保护能力。综上所述,本试验克隆表达的重组ChIFN-γ具有很好的生物学活性。在ChIFN-γ联合亲流管灭疫苗免疫保护实验中,不但能促进机体的细胞免疫应答,还能提高机体体液免疫应答的能力,进而促进机体产生较强的免疫力以抵抗病毒的攻击。本试验为进一步研究ChIFN-γ的生物活性和免疫增强作用提供了试验依据。