【摘 要】
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棘球蚴病主要在我国西部地区流行,是严重影响人畜健康、制约经济发展的人畜共患病之一,可给畜牧业造成重大经济损失。因其发病率和死亡率较高,使我国西部多数家庭因病致贫、因病返贫。此病已被世界卫生组织（WHO）列为法定报告动物疫病,我国农业部将其列入三类动物疾病,卫生部将其列为丙类传染病。本研究通过将EgM123蛋白免疫BALB/c小鼠,制备EgM123蛋白单克隆抗体,为后续建立细粒棘球绦虫检测方法提供前
【基金项目】
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“新疆维吾尔自治区教育厅高校科研计划青年基金项目”（项目编号:XJEDU2019Y023）项目主持人:翟少华副教授； “自治区农区高效肉羊品种选育推广技术体系”（项目编号:xjnqry-g-2006）项目主持人:夏俊研究员； “新疆农业大学研究生实践创新项目”（项目编号:XJAUGRI2020024）项目主持人:王楠（新疆农业大学
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棘球蚴病主要在我国西部地区流行,是严重影响人畜健康、制约经济发展的人畜共患病之一,可给畜牧业造成重大经济损失。因其发病率和死亡率较高,使我国西部多数家庭因病致贫、因病返贫。此病已被世界卫生组织（WHO）列为法定报告动物疫病,我国农业部将其列入三类动物疾病,卫生部将其列为丙类传染病。本研究通过将EgM123蛋白免疫BALB/c小鼠,制备EgM123蛋白单克隆抗体,为后续建立细粒棘球绦虫检测方法提供前期基础。1.使用Ecor I和Xho I限制性内切酶分别将p ET28a和pc DNA3.1/His-EgM123双酶切,1%琼脂电泳跑胶回收目的基因,将胶回收产物使用T4连接酶过夜连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,提取菌液内质粒,经双酶切、PCR和测序检测,将构建成功质粒转化BL21感受态细胞,使用IPTG诱导EgM123蛋白表达,摸索在不同温度、时间和IPTG浓度下蛋白表达量,使用镍柱亲和层析方法纯化EgM123蛋白、透析方法将纯化后蛋白复性,通过Western blot和ELISA检测其反应原性,并确定ELISA实验中EgM123蛋白最佳包被浓度。结果显示经双酶切、PCR和测序检测成功构建p ET28aEgM123原核表达载体,经IPT G诱导大肠杆菌表达的EgM123蛋白为包涵体蛋白,最佳诱导温度为37℃,最佳诱导时间为7 h,最佳IPTG诱导浓度为0.9 m M,经Western blot验证EgM123蛋白可分别与His单克隆抗体和犬EgM123多克隆抗体结合,经ELISA检测EgM123蛋白最佳包被浓度为每孔0.4μg。2.将EgM123蛋白免疫BALB/c小鼠,三次免疫后使用ELISA方法检测小鼠血清效价,选择效价最高小鼠,使用PEG4 000将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,按照有限稀释法进行亚克隆,使用秋水仙素作用成功筛选的细胞并进行吉姆萨染色确定染色体核型,使用ELISA法检测抗体亚型。结果显示免疫后小鼠血清效价均达1:25 600,选择1号小鼠进行融合,成功筛选出阳性杂交瘤细胞G2,经吉姆萨染色后染色体数为92对,经鉴定抗体亚型重链为Ig G1,轻链为Kappa。本研究成功制备具有反应原性的EgM123蛋白,免疫BALB/c小鼠可产生较高抗体水平,经细胞融合与阳性杂交瘤细胞筛选,成功制得单克隆抗体,抗体亚型重链为Ig G1,轻链为Kappa。
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