肝纤维化发病过程以细胞外基质异常增生和过度沉积为特征,机体的免疫系统在其中也扮演着重要角色。Th22细胞是一种新发现的CD4+T辅助细胞亚群,以分泌IL-22为特征。研究表明,Th22细胞参与了人和动物多种自身免疫性疾病的发病过程。目前动物实验及临床研究均提示Th22细胞亚群及其效应分子IL-22可能参与了肝纤维化的发病过程。但在肝纤维化发病过程中Th22细胞的变化规律如何?相关细胞因子变化及其相互关系如何?目前无相关研究。为进一步了解Th22细胞在肝纤维化发病过程中的变化,阐明Th22细胞及IL-22在肝纤维化中的作用、寻求肝纤维化新的治疗,本课题应用BALB/C小鼠腹腔注射CCL4建立肝纤维化小鼠模型,及予IL-22干预肝星状细胞,进行以下三方面研究。第---部分Th22及相关因子在肝纤维化小鼠中的动态变化目的：观察小鼠肝纤维化发病过程中Th22细胞及其相关细胞因子IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-α的动态演变,探讨Th22细胞及其细胞因子在肝纤维化中的作用及意义。方法：雄性Balb/c小鼠72只,体重22-25g,随机(按随机数字表法)分为模型组(n=40)和对照组(n=32)。两组小鼠均设0(注射前)、4、8、12周4个时点亚组,模型组的每个时点亚组10只。对照组的每个时点亚组8只。对照组腹腔内注射橄榄油,2mg/kg体重,每周2次；模型组腹腔内注射CCL4,浓度20%,2mg/kg体重,每周2次,各组小鼠在规定时点处死；HE和Masson染色观察小鼠肝脏病理改变并根据Ishak评分系统评估肝纤维化的程度；免疫组织化学染色检测肝脏组织中α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)及IL-22的表达；流式细胞术(FCS)检测小鼠脾Th22细胞数变化RT-PCR检测肝脏组织Th22相关细胞因子IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-amRNA的表达,ELISA检测血浆中IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-a蛋白的表达。结果：(1)肝组织病理切片HE染色显示：随着造模时间的延长,肝细胞变性、坏死,逐渐形成纤维间隔,肝小叶结构紊乱,最终形成假小叶。Masson染色镜下观察可见模型组的肝组织汇管区、中央静脉大量胶原纤维沉积,肝小叶被宽窄不一的纤维间隔分割。(2)免疫组织化学染色分析结果显示：随造模时间的延长,模型组a-SMA表达量逐渐增加,除0周时点外,模型组其他时点a-SMA蛋白表达量均高于对照组(P<0.01)。(3)流式细胞术分析结果显示：模型组小鼠第4周时脾脏Th22细胞比例开始升高,并一直持续至12周。除0周时点外,模型组Th22细胞比例均高于对照组的相应时点(P<0.01)。(4)模型组小鼠第4周时肝脏组织IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-amRNA的表达量开始升高,并一直持续至12周。除0周时点外,模型组的肝组织IL-22、IL-17A、IFN-y、IL-6和TNF-amRNA的表达量均高于对照组的相应时点(P<0.01)。(5)模型组小鼠第4周时外周血IL-22、TL-11A、IFN-γ、IL-6和TNF-a蛋白的表达量开始升高,并一直持续至12周。除0周时点外,模型组的外周血IL-22、IL-17A、IFN-γ IL-6和TNF-a的表达量均高于对照组的相应时点(P<0.01)。(6)模型组小鼠第4周时肝脏组织IL-22蛋白的表达量开始升高,并一直持续至12周。除0周时点外,模型组的肝组织IL-22的表达量均高于对照组的相应时点(P<0.01)。结论：Th22及相关细胞因子在肝纤维化小鼠中呈高表达。第二部分重组IL-22抑制小鼠肝纤维化的体内研究目的：观察体内重组IL-22对肝纤维化小鼠的干预作用,从而进一步确定Th22细胞及其效应因子IL-22在肝纤维化中的作用。方法：6周龄雄性BABL/c小鼠16只均腹腔注射20%CCL4,每周2次,在造模后第8周起,随机分成2组：重组IL-22组(n=8,rmIL-22组)和对照组(n=8,carrier组)。重组IL-22和carrier组小鼠分别腹腔注射0.3μg/grm1L-22和等体积溶剂0.5%BSA(in PBS, pH7.0),每天1次,一直到第10周。第10周时处死小鼠,并收集外周血、血浆、脾脏及肝脏组织等标本；HE和Masson染色了解肝脏病理改变及根据Ishak评分系统评估肝纤维化的程度；免疫组织化学染色检测肝脏组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和IL-22的表达；RT-PCR检测小鼠肝脏组织IL-22、IL-22R1、IL-10R2、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-amRNA的表达,ELISA检测血浆中IL-22、IL-17A、IFN-γ、IL-6和TNF-a蛋白表达、FCS检测两组小鼠脾脏Th22细胞数变化。结果：(1)与对照组相比,重组IL-22可改善肝纤维化小鼠的肝纤维化,程度、降低肝纤维化病理积分,减少肝脏中a-SMA蛋白的表达(P<0.05)。(2)与对照组相比,重组IL-22降低脾Th22亚群细胞的增殖,同时减少小鼠肝脏组织中IL-22蛋白和血浆中IL-22蛋白的水平,并降低肝脏组织IL-22、IL-22R1和IL-10R2mRNA的表达(P<0.05)。(3)与对照组相比,重组IL-22降低小鼠血浆中IL-17A、IFN-y、TNF-a和IL-6蛋白的水平及降低肝脏组织IL-17A、IFN-γ、TNF-α和IL-6 mRNA的表达(P<0.05)。结论：IL-22通过抑制HSC活性及炎症因子改善肝纤维化。第三部分重组IL-22抑制肝星状细胞增殖的体外研究目的：研究重组IL-22对肝星状细胞(HSCs)增殖和活化的影响及其对纤维化相关蛋白的调节作用。方法：将SD大鼠原代肝星状细胞(HSCs)分为3组,①对照组：HSCs单独培养；②实验组a：重组IL-22(10ng/ml)干预HSCs;③实验组b：重组IL-22(20ng/ml)干预HSCs。各组分别培养24h、48h和72h,于倒置相差显微镜下动态观察细胞形态学的变化；免疫组化法检测HSCs中α-平滑肌蛋白(a-SMA)的表达量；四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测IL-22对HSCs的最佳干预浓度；荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HSCs中a-SMA、 TGF-β1和TIMP-1mRNA的表达水平。结果：1.倒置相差显微镜下观察,可见状态良好的HSCs呈膜状生长,呈典型的星形或多边形,胞内较多颗粒。免疫组织化学染色法结果显示：培养48h的HSCs可见胞浆内棕黄色颗粒,即α-肌动蛋白表达阳性,95%以上的活化的HSCs呈阳性表达。2.与对照组相比,不同浓度的IL-22在24h、48h和72h后对肝星状细胞均有抑制作用(P<0.05),浓度为20 ng/ml时肝星状细胞的抑制作用最明显,与其他各浓度比较,统计学上有显著差异(P<0.05)。3.实验组的a-SMA. TGF-β1和TIMP-1mRNA表达量随着培养时间延长而降低,比对照组的相应时间段表达量低,统计学有显著差异P<0.05)。结论：IL-22通过抑制HSC增殖及活化降低促纤维化因子水平。