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研究背景和目的:冠心病是临床常见疾病,是心肌缺血缺氧引起的心脏疾病。研究发现P2X7受体参与伤害性信息的传递,且嘌呤受体参与心血管功能活动及疾病过程。长非编码RNA(Long noncoding RNAs,LncRNAs)可以通过影响mRNA的转录、拼接、转运、稳定性和翻译等过程,从而调节蛋白质基因的表达。LncRNAs涉及神经系统疾病的发病机制。前期研究发现颈部交感神经节存在属于长非编码RNA的类似信使核糖核酸的非编码核糖核酸(messenger-like noncoding RNA2,mlncRNA2),mlncRNA2在一些复杂疾病的发生过程中异常表达,本研究旨在探讨mlncRNA2小干扰RNA对P2X7受体在心肌缺血损伤介导交感神经功能与形态异常的病理生理变化的作用及可能机理,并与P2X7受体拮抗剂BBG、P2X7siRNA的作用进行比较,为冠心病的预防和治疗提供新的理论基础。方法:本实验采用结扎心脏左冠状动脉前降支制备心肌缺血大鼠模型。实验大鼠随机分组为:生理盐水对照组(Con)、假手术组(Sham)、心肌缺血模型组(MI)、心肌缺血模型BBG干预组(MI+BBG)、P2X7 siRNA干扰心肌缺血模型组(MI+P2X7 si)、mlncRNA2 的 siRNA 干扰心肌缺血模型组(MI+mlncRNA2 si)、转染阴性对照组(MI+ScramblesiRNA,MI+SCsi)。实验内容:(1)结扎大鼠左冠状动脉前降支建立大鼠心肌缺血动物模型,通过心电图ST段改变确定建模效果。通过心肌HE染色观察心肌缺血模型大鼠心肌形态的变化;(2)使用无创法血压计测量大鼠的血压和心率,观察心肌缺血大鼠血压、心率的变化,并与Con组、Sham 组、MI+BBG 组、MI+P2X7si 组、MI+mlncRNA2si 组、MI+SCsi 相比较;(3)监测术前、术后各实验组大鼠的心电图,并应用分析软件对其心率变异性(HRV)进行分析,记录心脏自主神经功能的变化;(4)测量各实验组大鼠血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度;(5)应用Real-time PCR检测大鼠颈上神经节(SCG)及星状神经节(SG)中mlncRNA2及P2X7受体mRNA的表达量的变化;(6)免疫组织化学方法检测各实验组缺血心肌周围的神经纤维分布和密度变化;(7)免疫组织化学及蛋白印迹观察各实验组大鼠颈上、星状交感神经节P2X7受体的表达情况,以及蛋白印迹检测P38和ERK1/2的磷酸化程度;(8)免疫组织化学观察各实验组大鼠颈上、星状交感神经节肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)的表达变化;(9)应用酶联免疫吸附试验(EIISA)检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、去甲肾上腺素(NA)、肾上腺素(EPI)的含量。结果:(1)Real-time结果显示,心肌缺血模型大鼠的SCG和SG中mlncRNA2的表达量要明显高于正常大鼠(n=3)(p<0.01);(2)结扎大鼠心脏左冠状动脉前降支后心电图与术前相比,ST段呈弓背抬高,表明建模成功;心肌缺血损伤30天后,心肌纤维凝固性坏死,核碎裂消失,胞质均成不规则粗颗粒状,间质水肿,而正常心肌纤维染色为粉红色,胞质和胞核显示清晰,细胞膜完整,细胞排列规则,细胞间隙适中。心肌缺血模型大鼠应用BBG、P2X7 siRNA及mlncRNA2siRNA处理后可缓解缺血大鼠的心肌损伤;(3)MI组大鼠收缩压、舒张压、心率较 Con 组、Sham 组、MI+BBG 组、MI+P2X7 si 组、MI+mlncRNA2 si 组增大(n=5)(p<0.01,F(sBP)(5,24)=7.97,F(DBP)(5,24)= 7.09,F(HR)(5,24)=8.32)。转染阴性对照组MI+SC si与MI组的大鼠收缩压、舒张压、心率无明显差异(n=5)(p>0.05),Con 组、Sham 组、MI+BBG 组、MI+P2X7si 组、MI+mlncRNA2si 组之间无显著差异(n=5)(p>0.05,F(SBP)(4,20)=2.10,F(DBP)(4,20)=1.43,F(HR)(4,20)=1.24);(4)MI 组术后30天,出现深大的病理性Q波,结合HE染色结果表明出现明显的心肌缺血损伤。HRV分析结果显示,心肌缺血模型组低频功率(LF)、高频功率(HF)、窦性R-R间期差数的均方根和(RMSSD)、窦性R-R间期标准差(SDANN)比Con 组、Sham 组、MI+BBG 组、MI+P2X7si 组、MI+mlncRNA2si 组明显降低(n=10)(p<0.01,F(LF)(5,54)=43.27,F(HF)(5,54)=21.41,F(rMSSD)(5,54)=28.24,F(SDANN)(5,54)=19.56),LF/HF的值却比其它五个实验组要显著增大(n=10)(p<0.01,F(LF/HF)(6,63)=6.22);Con 组、Sham 组、MI+BBG 组、MI+P2X7 si 组、MI+ mlncRNA2 si 组之间无显著差异(n=10)(p>0.05,F(LF)(4,45)=1.48,F(HF)(4,45)=1.73,F(RMSSD)(4,45)=2.21,F(SDANN)(4,45)=2.35,F(LF/HF)(4,45)=1.64);(5)心肌缺血模型组的 CK-MB、CK、LDH 和 AST 浓度与 Con 组、Sham 组、MI+BBG 组、MI+P2X7 si 组、MI+ mlncRNA2 si 组相比显著增加(n=8)(p<0.01,F(CK-MB)(5,42)=3.76,F(Ck)(5,42)=10.23,F(LDH)(5,42)=7.14,F(AST)(5,42)=5.34),而MI组与 MI+SC si 组间无明显差异(p>0.05),Con、Sham、MI+BBG、MI+ mlncRNA2 si、MI+P2X7 si 组间也无显著差异(p>0.05,F(CK-MB)(4,35)=1.03,F(CK)(4,35)=1.46,F(LDH)(4,35)=1.57,F(AST)(4,35)=2.04);(6)通过免疫组化染色观察到,MI组缺血周边区生长相关蛋白43(GAP43)和酪氨酸羟化酶(TH)阳性纤维明显增多(n=6)(p<0.01),增粗甚至聚集成网状结构,空间分布紊乱。TH/GAP43的比值显著增高(n=6)(p<0.01,F(5,30)=5.42),提示新生的神经纤维以交感神经为主;(7)免疫组化(n=10)、蛋白印迹(n=6)结果显示MI组大鼠颈上、星状交感神经节细胞P2X7受体蛋白的表达明显高于Con组、Sham组、MI+BBG 组、MI+P2X7 si 组、MI+mlncRNA2 si 组(p<0.01),组化-F(sCG)(5,54)=34.76,F(sG)(5,54)=29.43;蛋白印迹-F(sCG)(5,30)=60.58,F(sG)(5,30)=47.66)。转染阴性对照组MI+SC si 与 MI 组无明显差异(p>0.05),Con 组、Sham 组、MI+BBG 组、MI+P2X7 si 组、MI+ mlncRNA2 si 组之间无显著差异(p>0.05,组化-F(SCG)(4,45)=1.68,F(SG)(4,45)=2.12;蛋白印迹-F(SOG)(4,25)=2.34,F(sG)(4,25)=1.91);(8)免疫组化染色结果显示,MI组大鼠颈上、星状交感神经节细胞TNF-α、IL-6的表达较Con组、Sham组、MI+BBG 组、MI+P2X7si 组、MI+mlncRNA2 si 组显著增加(n=10)(p<0.01,TNF-α-F(sCG)(5,54)=49.41,F(sG)(5,54)=37.36;IL-6-F(sCG)(5,54)= 52.10,F(sG)(5,54)=43.57)。转染阴性对照组MI+SC si组与MI组无明显差异(n=10)(p>0.05),Con组、Sham组、MI+BBG 组、MI+P2X7 si 组、MI+mlncRNA2 si 组之间无显著差异(n=10)(p>0.05,TNF-a-F(sCG)(4,45)=1.43,F(SG)(4,45)=1.94;IL-6-F(SCG)(4,45)=3.15,F(SG)(4,45)=2.76);(9)蛋白印迹结果显示,MI组大鼠颈上、星状交感神经节P38和ERK1/2的磷酸化程度明显高于Con组、Sham组、MI+BBG组、MI+P2X7 si组、MI+mlncRNA2 si 组(n=6)(p<0.01,p-P38-F(sCG)(5,30)= 60.22,F(sG)(5,30)=53.43;p-ERKl/2-F(sCG)(5,30)=63.67,F(SG)(5,30)=55.19),Con 组、Sham 组、MI+BBG 组、MI+P2X7 si组、MI+mlncRNA2 si 组之间无显著差异(n=6)(p>0.05,p-P38-F(SCG)(4,25)=2.06,F(sG)(4,25)=2.45;p-ERKl/2-F(SCG)(4,25)=2.51,F(sG)(4,25)=1.45);(10)ELISA 结果表明,MI组大鼠血清中TNF-α、IL-6、NA、EPI的含量较Con组、Sham组、MI+BBG 组、MI+P2X7 si 组、Ml+mlncRNA2 si 组明显增加(n=6)(p<0.01,F(IL-6)(5,30)=6.54,F(TNF-α)(5,30)=4.72,F(NA)(5,30)=4.58.,F(EPl)(5,30)=4.96),Con 组、Sham组、MI+BBG 组、MI+P2X7 si 组、MI+ mlncRNA2 si 组之间无明显差别(n=6)(p>0.05,F(IL-6)(4,25)=2.27,F(TNF-α)(4,25)=2.18,F(NA)(4,25)=1.15,F(EPI)(4,25)=1.36)。结论:心肌缺血大鼠颈上、星状交感神经节P2X7受体表达升高,P2X7受体特异性拮抗剂BBG、P2X7siRNA及mlncRNA2 siRNA处理后,心肌缺血大鼠颈上、星状交感神经节P2X7受体表达降低,心肌交感神经的高支配现象得到抑制,从而抑制交感神经兴奋反射的信息传递。因此,mlncRNA2小干扰RNA可降低大鼠颈上、星状交感神经节P2X7受体参与心肌缺血伤害性信息引发的交感兴奋反射过程,对心肌缺血损伤产生保护作用。