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第一部分:胃癌中HMGA2的表达及临床相关性目的:研究胃癌中HMGA2的表达及与临床病理特征和预后的关系方法:1、利用TCGA数据库、GTEx数据库及生物信息学分析工具(GEPIA、KM plotter)对HMGA2mRNA在胃癌中的表达及患者生存时间进行分析。2、收集2018年6月-2018年12月于西南医院普通外科治疗的胃癌组织标本72例,癌旁组织(距离肿瘤组织2cm以上)标本72例作为对照。所有患者术前均未行放疗、化疗,且不合并其他肿瘤。采用免疫组织化学染色方法检测HMGA2在胃癌及癌旁组织中的表达情况,并比较其表达差异。3、利用Ucsc xena网站下载TCGA STAD(胃癌)转录组测序数据,筛选HMGA2转录组测序数据同时匹配患者年龄、性别、T分期、M分期等相关临床资料,删除缺失数据之后,根据HMGA2 mRNA表达量分为高表达组和低表达组,分析HMGA2 mRNA表达水平与临床病理特征的相关性。结果:1、数据库分析发现胃癌组织中HMGA2mRNA表达相较于正常胃组织显著增加(P<0.05),且HMGA2mRNA高表达的胃癌患者,总生存期及无复发生存期均明显缩短(P<0.05)。2、胃癌组织中HMGA2阳性表达率为69.4%(50/72),明显高于癌旁组织12.5%(9/72)(P<0.05),差异有统计学意义。3、利用TCGA数据库成功筛选337包含患者完整临床信息的HMGA2测序数据。依据HMGA2mRNA表达量由高到低排序,前168例为低表达组;后169例为高表达组,结果显示HMGA2mRNA的表达水平在T分期具有统计学意义(P<0.05)。在性别、年龄肿瘤分化程度、病理分期、N分期、M分期方面无统计学差异(P>0.05)。结论:1、HMGA2在胃癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织,且与患者预后相关。2、HMGA2mRNA的表达与T分期相关,与性别、年龄、肿瘤分化程度、病理分期、N分期、M分期无相关性。第二部分:胃癌干细胞亚群的分离与鉴定目的:分离并鉴定静止性胃癌干细胞和侵袭性胃癌干细胞方法:1、胃癌干细胞的分离与鉴定。依据课题组前期成功培养胃癌干细胞的经验,选取MGC-803细胞株行成球培养,并通过transwell实验、平板克隆实验比较成球细胞和普通贴壁细胞的增殖侵袭能力,通过western blot检测干细胞标记物OCT3、ALDH1A1、Nanog在成球细胞与普通贴壁细胞中的表达。2、干细胞亚群的分选与鉴定。依据相关文献及课题组前期实验成果选取CD26和CXCR4作为EMT样胃癌干细胞的标志物,通过流式分选获取CD26+CXCR4+以及CD26-CXCR4-两种亚群细胞,并通过平板克隆实验、transwell实验比较两种亚群细胞的增殖侵袭能力,通过western blot检测EMT相关标志蛋白在两种亚群细胞的表达。结果:1、通过成球培养成功分离富集成球细胞,平板克隆实验、transwell实验结果显示成球细胞的增殖侵袭能力高于普通贴壁细胞。Western blot结果显示,与普通贴壁细胞相比,成球细胞的干细胞标记物表达水平更高。2、平板克隆实验、transwell实验结果显示CD26+CXCR4+细胞的增殖侵袭能力高于CD26-CXCR4-细胞。western blot结果显示,CD26+CXCR4+细胞的E-cadherin表达明显降低,vimentin的表达明显升高。结论:1、胃癌细胞无血清成球培养法获得的成球细胞具有干细胞特性,为胃癌干细胞2、以CD26、CXCR4作为侵袭性GCSCs的标记结合流式分选能够分离静止性GCSCs和侵袭性GCSCs3、侵袭性GCSCs具有EMT样特征,可能是由于静止性GCSCs发生EMT转化而来第三部分:HMGA2诱导生成EMT样胃癌干细胞及其机制研究目的:通过体外实验研究HMGA2诱导生成EMT样胃癌干细胞及其可能机制方法:1、通过慢病毒转染CD26-CXCR4-细胞,使其高表达HMGA2,transwell实验比较转染前后细胞侵袭能力的改变,western blot检测EMT相关标志蛋白的表达变化。2、通过查阅相关文献,分析后选取转录因子Snail作为研究对象。在高表达HMGA2的静止性胃癌干细胞中敲降Snail的表达,利用transwell实验检测细胞侵袭能力的变化,western blot检测EMT相关标志蛋白的表达变化。结果:1、Transwell实验结果显示转染HMGA2后CD26-CXCR4-细胞的侵袭能力增强,Western blot结果显示E-cadherin表达降低,N-cadherin、vimentin的表达升高。2、过表达HMGA2的静止性胃癌干细胞敲低Snail表达后侵袭能力明显降低(P<0.05),且E-cadherin的表达升高,N-cadherin和Vimentin的表达降低。结论:1、HMGA2能够增强静止性胃癌干细胞的侵袭能力,促使其转化为EMT样胃癌干细胞。2、HMGA2可能通过调控Snail的表达促进静止性胃癌干细胞与EMT样胃癌干细胞的转化。