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目的研究中药单体隐丹参酮对肝癌Hepa1-6细胞的抑制作用，建立Hepa1-6细胞小鼠皮下移植瘤模型，采用腹腔注射的给药方式来检测隐丹参酮对肝癌移植瘤体的抑制作用。在体外，培养Hepa1-6细胞，采用流式细胞术、蛋白质印迹法及RT-PCR等方法检测隐丹参酮对该细胞的增殖及凋亡的作用。进一步探讨隐丹参酮抗肝癌作用的相关机制。
方法
1.使用CCK-8法检测隐丹参酮对Hepa1-6细胞增殖活力的影响；流式细胞仪分析隐丹参酮对Hepa1-6细胞凋亡与周期的影响；蛋白质免疫印迹法检测隐丹参酮对Hepa1-6细胞内活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶Cleaved-PARP、CyclinD1、P21和P53表达的影响；RT-PCR法检测细胞凋亡相关基因P53、P21及Caspase9的表达。
2.Hepa1-6细胞株于37℃，5％CO2培养箱中培养。18只C57BL/6小鼠右侧背部皮下接种Hepa1-6肿瘤细胞，建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型，随机分成3组，每组6只。分别为模型组、隐丹参酮40mg/kg组及隐丹参酮20mg/kg组。皮下移植瘤模型成瘤后，每隔一天给一次药，给药周期是2周，采用的腹腔注射的给药方法，测量体重的时间是3天测量并记录体重一次。2周后，处死小鼠取出瘤组织。称量最终瘤体的重量瘤组，并且计算抑瘤率；Westernblot法检测Cleaved-PARP，PARP，Bcl-2及Caspase9蛋白的表达；通过免疫组织化学方法观察Hepa1-6细胞凋亡、增殖以及肿瘤组织中Bcl-2基因蛋白表达情况。
结果
1.隐丹参酮对Hepa1-6细胞增殖活力以及促凋亡的作用：
与对照组相比，分别给药24h、48h和72h后，隐丹参酮显著降低Hepa1-6细胞的增殖活力，并且呈剂量依赖性和时间依赖性。细胞凋亡率随着隐丹参酮浓度的增大而升高，细胞周期阻滞在G1期；能够显著抑制周期蛋白cyclinD1的表达，显著促进凋亡蛋白cleaved-PARP、p21和p53蛋白的表达。
2.隐丹参酮对小鼠皮下移植瘤的作用：
给药第7天，观察得出模型组小鼠与给药组比较开始消瘦，毛色暗淡，右侧背部肿瘤隆起程度高于给药组，行动灵敏度下降，直到实验结束平均体重逐渐减小，给药组小鼠平均体重均较给药前有明显增加；模型组、隐丹参酮40mg/kg组及隐丹参酮20mg/kg组比较差异具有统计学意义(p＜0.05)，给药组抑瘤率分别为55.83%和27.91%；蛋白免疫印迹实验结果表明，隐丹参酮40mg/kg组与模型组比较，隐丹参酮显著上调凋亡相关蛋白CleavedPARP、PARP、Caspase9，下调抗凋亡相关蛋白Bcl-2；HE染色表明，隐丹参酮40mg/kg给药组能明显诱导组织坏死；免疫组化实验表明，TUNEL阳性细胞明显增多，隐丹参酮40mg/kg组可以诱导Hepa1-6细胞凋亡；Ki67阳性细胞明显减少，隐丹参酮40mg/kg组能明显抑制Hepa1-6细胞增殖；Bcl-2基因阳性细胞数明显少于模型组，隐丹参酮40mg/kg组可以下调凋亡基因Bcl-2的表达。
结论隐丹参酮对Hepa1-6细胞小鼠皮下移植瘤的生长起抑制作用。隐丹参酮通过紊乱细胞周期，使得Hepa1-6细胞的增殖活力下降，并且诱导细胞产生凋亡，其凋亡途径可能的机制与Bcl-2、P53、P21及Caspase9关系密切，Bcl-2基因抑制细胞的凋亡，另三个基因促进细胞的凋亡：体内实验证明隐丹参酮可以抑制瘤体的增长。
方法
1.使用CCK-8法检测隐丹参酮对Hepa1-6细胞增殖活力的影响；流式细胞仪分析隐丹参酮对Hepa1-6细胞凋亡与周期的影响；蛋白质免疫印迹法检测隐丹参酮对Hepa1-6细胞内活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶Cleaved-PARP、CyclinD1、P21和P53表达的影响；RT-PCR法检测细胞凋亡相关基因P53、P21及Caspase9的表达。
2.Hepa1-6细胞株于37℃，5％CO2培养箱中培养。18只C57BL/6小鼠右侧背部皮下接种Hepa1-6肿瘤细胞，建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型，随机分成3组，每组6只。分别为模型组、隐丹参酮40mg/kg组及隐丹参酮20mg/kg组。皮下移植瘤模型成瘤后，每隔一天给一次药，给药周期是2周，采用的腹腔注射的给药方法，测量体重的时间是3天测量并记录体重一次。2周后，处死小鼠取出瘤组织。称量最终瘤体的重量瘤组，并且计算抑瘤率；Westernblot法检测Cleaved-PARP，PARP，Bcl-2及Caspase9蛋白的表达；通过免疫组织化学方法观察Hepa1-6细胞凋亡、增殖以及肿瘤组织中Bcl-2基因蛋白表达情况。
结果
1.隐丹参酮对Hepa1-6细胞增殖活力以及促凋亡的作用：
与对照组相比，分别给药24h、48h和72h后，隐丹参酮显著降低Hepa1-6细胞的增殖活力，并且呈剂量依赖性和时间依赖性。细胞凋亡率随着隐丹参酮浓度的增大而升高，细胞周期阻滞在G1期；能够显著抑制周期蛋白cyclinD1的表达，显著促进凋亡蛋白cleaved-PARP、p21和p53蛋白的表达。
2.隐丹参酮对小鼠皮下移植瘤的作用：
给药第7天，观察得出模型组小鼠与给药组比较开始消瘦，毛色暗淡，右侧背部肿瘤隆起程度高于给药组，行动灵敏度下降，直到实验结束平均体重逐渐减小，给药组小鼠平均体重均较给药前有明显增加；模型组、隐丹参酮40mg/kg组及隐丹参酮20mg/kg组比较差异具有统计学意义(p＜0.05)，给药组抑瘤率分别为55.83%和27.91%；蛋白免疫印迹实验结果表明，隐丹参酮40mg/kg组与模型组比较，隐丹参酮显著上调凋亡相关蛋白CleavedPARP、PARP、Caspase9，下调抗凋亡相关蛋白Bcl-2；HE染色表明，隐丹参酮40mg/kg给药组能明显诱导组织坏死；免疫组化实验表明，TUNEL阳性细胞明显增多，隐丹参酮40mg/kg组可以诱导Hepa1-6细胞凋亡；Ki67阳性细胞明显减少，隐丹参酮40mg/kg组能明显抑制Hepa1-6细胞增殖；Bcl-2基因阳性细胞数明显少于模型组，隐丹参酮40mg/kg组可以下调凋亡基因Bcl-2的表达。
结论隐丹参酮对Hepa1-6细胞小鼠皮下移植瘤的生长起抑制作用。隐丹参酮通过紊乱细胞周期，使得Hepa1-6细胞的增殖活力下降，并且诱导细胞产生凋亡，其凋亡途径可能的机制与Bcl-2、P53、P21及Caspase9关系密切，Bcl-2基因抑制细胞的凋亡，另三个基因促进细胞的凋亡：体内实验证明隐丹参酮可以抑制瘤体的增长。