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稻瘟病作为一种重要农业病害,是由稻瘟菌(Magnaporthegrisea)所引起的。甾醇14a-去甲基化酶(CYP51)真菌细胞膜组分麦角甾醇合成过程中的一个关键酶,是抗真菌药物作用和设计重要靶标。而目前三唑类药物作为一种甾醇14a-去甲基化酶的抑制剂(DMIs),在日常生活中被广泛用作抗真菌剂,但是由于其作用位点单一和越来越多的抗药菌株的出现,研究新型,高效,低毒的DMIs具有重要的意义。本研究就主要从以下两个方面入手,研究稻瘟菌和其CYP51对于三唑类药物敏感性差异的机制,为DMIs的设计提供依据。一方面分析不同稻区稻瘟菌对三唑类药物敏感性差异机制。从湖北、湖南、黑龙江、江苏四个省份索要稻瘟菌共49株,分析了烯唑醇、戊唑醇、三唑醇、三唑酮和丙环唑五种三唑类药物对这49株菌的抑制率,结果表明CY8、YA10、101301对三唑类的敏感性较高,5种药物对它们的抑制率都较高,戊唑醇对于CY8、YA10、101301菌株的抑制率达到了 100%,三唑酮对于101301菌株的抑制率也达到100%;同时,5种药物对1-1-6、CY3、CY6及HM2抑制率都相对较小,因此以此7株菌作为对象,研究三唑类药物敏感性差异的机制。①通过REP-PCR技术采用M13和pot2引物对这7株菌采用进行DNA指纹分析,发现遗传背景的差异不是导致三唑类药物敏感性差异的原因;②对这7株菌CYP51 F1和CYP51F2基因进行序列分析,发现不敏感菌株HM2及CY6菌株CYP51 F2的第312位上均发生了同样的改变:由Ser(TCG)突变成了 Leu(TTC),推测此位点的变化是引起菌株对三唑类药物不敏感的原因之一;③通过对F1和F2基因表达量的分析,发现所有7株菌种CYP51F2基因的表达量都低于CYP51F1基因表达量;其中较为敏感的CY8和YA10的F1和F2基因表现量显著性高于其他菌株(p<0.05),但菌株101301的表达量却较低;不敏感的菌株CY6的F1和F2基因的表达量是显著性的低于其他菌株(p<0.05),其他三株菌的表达量却较高;说明CYP51基因的表达量不是引起稻瘟菌对三唑类药物敏感性差异的原因。第二方面通过稻瘟病菌CYP51突变体与三唑类药物烯唑醇的进行结合实验,分析MGCYP51对烯唑醇的敏感性差异机制。以MG-CYP51F2作为研究对象,从与底物结合区域:B’螺旋-BC loop(SRS1)、C螺旋的N端、K/β1-4loop-β1-4(SRS5)和β4hairpin(SRS6)以及与药物选择性抑制相关的F螺旋区,选取了 11个保守性较高氨基酸位点来进行突变,构建了 19个突变体,再加上原先实验室已经构建好的SRS5和SRS6区19个突变体,共获得38个MG-CYP51突变体。这些突变体均在大肠杆菌BL21(DE3)Rossta菌株中获得过量表达,采用结合光谱法分析38个MG-CYP51突变体与烯唑醇的结合能力。结果表明所有突变体均能与烯唑醇结合,呈现出Ⅱ型的结合光谱,所有的38株突变体与烯唑醇的Kd值有了不同程度的增大,结合能力都下降。根据不同突变体的Kd值变化,确定位于F螺旋区的P222、SRS5区的1367、K373、V374以及SRS6区的S497、R498和M500这七个位点为与抑制剂结合关键位点,在抑制剂结合中发挥重要作用,以上这两方面的研究结果都为新型特异高效的的稻瘟病菌DMIs药物研发提供理论依据。