捻转血矛线虫（Haemonchuscontortus）属毛圆科（Trichostrongylidae）血矛属（Haemonchus）线虫，是山羊等反刍动物的主要胃肠道寄生虫之一，患病动物通常表现为贫血、消瘦甚至死亡，造成巨大经济损失。目前的主要防治方法是使用化学药物驱虫，但随着抗药性虫株的出现，化学药品治疗正受到严重的挑战，人们正努力寻求通过免疫学的方法，代替化学药物控制该病。　　 目前，捻转血矛线虫免疫学方面的研究已取得了重要进展，但尚无商品化疫苗用于该病的防控。对该寄生虫发育与调控研究可深入了解其生物学特性，从而为控制该病提供更多的研究思路。本研究进行了捻转血矛线虫Hcher-1和HcMSP基因的克隆和原核表达，研究了其部分生物学特性，并对其在各发育阶段的表达情况进行了定量分析，并对其在虫体发育过程中的功能做出了预测。　　 1.捻转血矛线虫Hcher-1基因的克隆、表达及免疫原性分析　　 根据C.elegans,C.briggsa和B.malayi的her-1基因保守序列设计引物，从捻转血矛线虫cDNA中扩增出597bp的DNA片段，经克隆测序后以此EST为基础，利用5RACE和3RACE技术分别获得该基因的5端和3端未知序列，将这些序列拼接后获得捻转线虫Hcher-1基因的全长cDNA序列(1091bp)，序列分析发现，该基因含有一个960bp的最大开放阅读框（ORF）、67bp5非翻译区和64bp3非翻译区。根据此ORF设计1对特异性引物，以捻转血矛线虫的总RNA为模板，采用RT-PCR技术，扩增出960bp的DNA片段，与推导的ORF长度相同。将该片段克隆到pET-28a(+)载体中，转化大肠杆菌Rosseta，用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达，分子量约38kDa。以该重组蛋白免疫大鼠制备血清作为一抗，westernblot分析天然HcHER-1蛋白，结果在约35kDa处出现特异性条带，与其理论大小一致。　　 2.捻转血矛线虫HcMSP基因的克隆、表达及免疫原性分析　　 根据捻转血矛线虫雄虫总蛋白的质谱分析结果和GenBank中秀丽新杆线虫主要精子蛋白(MSP)核苷酸序列(登录号为173888)设计一对特异性引物，利用RT-PCR技术获得捻转血矛线虫HcMSP基因的表达序列标签EST。依据此EST设计基因特异性引物，利用5RACE和3RACE技术分别获得该基因的5端和3端未知序列，将这些序列拼接后获得捻转血矛线虫HcMSP基因的全长cDNA序列(439bp)。序列分析发现，该基因含有一个381bp的最大开放阅读框(ORF)、17bp5非翻译区和41bp3非翻译区。根据此ORF设计1对特异性引物，以捻转血矛线虫的总RNA为模板，采用RT-PCR技术，扩增出381bp的产物。将该片段连接到原核表达质粒pET28a(+)，转化大肠杆菌Rosseta，IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明重组蛋白在上清和包涵体中均有表达，分子量约为18kDa。以自然感染山羊血清为一抗，westernblot分析未发现相应条带，说明捻转血矛线虫主要精子蛋白可能是一种隐蔽抗原。以该重组蛋白免疫大鼠制备血清为一抗，westernblot分析，天然HcMSP蛋白分子量约为15kDa。　　 3.Hcher-1和HcMSP基因阶段性表达特性分析　　 根据前期工作克隆到的捻转血矛线虫Hcher-1和HcMSP基因全长序列设计荧光定量PCR引物。SYBRGreenⅠ染料荧光定量法对所设计引物的扩增效率验证，筛选符合要求的引物。用ΔΔCt法对这两个基因在捻转血矛线虫的虫卵期，第三期幼虫期，雌虫和雄虫中的表达情况进行定量分析。结果显示Hcher-1在雄虫中表达量最高，虫卵和三期幼虫其次，约为雄虫表达量的1/3，雌虫中最低，约为雄虫表达量的1/8;HcMSP在雄虫中的表达量最高，虫卵其次，约为雄虫表达量的1/8，雌虫和三期幼虫最低，约为雄虫的1/800。