论文部分内容阅读
重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是由自身抗体介导、T细胞参与、补体依赖的自身免疫性疾病,其致病性自身抗体以及病理作用靶点明确,动物模型易建立,是研究自身免疫性疾病治疗手段的理想模型之一。位于神经肌肉接头突触后膜的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor, AChR)是MG致病性自身抗体攻击的靶点,患者体内的抗AChR抗体与AChR结合后,在补体等因素协同下破坏突触后膜的AChR,临床出现横纹肌收缩无力等症状,严重者累及呼吸肌出现肌无力危象而死亡。目前主要采用胆碱酯酶抑制剂和免疫抑制剂进行治疗,但治疗效果仍然不理想。因此,人们一直在探索一种特异而有效的治疗手段。近年来,越来越多的证据表明B淋巴细胞在免疫应答中具有更为广泛的作用,而不仅仅是被动接受信号刺激而分泌抗体。B细胞还可以递呈抗原、调节抗原递呈细胞和T细胞的功能、分泌多种细胞因子,并表达以往认为只限于其他细胞类型的多种受体/配体。而当机体免疫系统对自身成分失耐受时,病理性B细胞的作用就更加复杂,也更加重要,尤其在以自身抗体为主要效应机制的体液自身免疫性疾病中。因此,以B细胞为靶细胞进行免疫治疗将会有效控制多种自身免疫性疾病。鉴于AChRAb是MG的重要致病因子,如果能从源头上清除分泌AChRAb的B细胞,将会有效控制病情。然而,目前尚无特异性清除AChR反应性B细胞的手段。本研究拟将AChRα亚单位胞外段基因与Fc基因连接,表达AChR-Fc融合蛋白,其AChRα亚单位胞外段特异性结合AChR反应性B细胞,同时Fc段结合该B细胞表面抑制性受体FcγRⅡB,抑制B细胞活化、促进其凋亡,或Fc结合于单核-巨噬细胞、补体表面的Fcγ受体,介导单核-巨噬细胞或补体对该致病B细胞的特异性杀伤。我们利用AChRAb杂交瘤细胞分析融合蛋白的结合、抑制作用以及其介导的细胞毒作用,同时用重组表达的AChRα亚单位胞外段(extracellular domain,ECD)蛋白免疫Lewis大鼠制备实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)动物模型,分别通过体外以及在体研究,观察融合蛋白对AChR反应性B细胞的作用。一、AChR-Fc融合蛋白的表达、纯化和鉴定以AChRα亚单位基因片段为模板,通过PCR的方法扩增AChRα亚单位胞外段全长基因片段(Hα1-210),将其插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从铰链区到CH3的基因片段的真核表达载体pAN1782中,构建重组表达载体pAN-Hα1-210;瞬时转染CHO-K1细胞后取上清,ELISA和Western blot鉴定AChR-Fc融合蛋白的表达;G418筛选转染后细胞,建立稳定表达细胞系;Protein A亲和层析柱纯化表达的融合蛋白,SDS-PAGE进一步分析AChR-Fc融合蛋白的表达和纯度。二、体外细胞系实验分析AChR-Fc融合蛋白对分泌AChRAb杂交瘤细胞的结合和抑制作用用含10%胎牛血清(fetal calf serum, FCS)RPMI1640适应性培养分泌AChRAb的杂交瘤细胞系TIB175,利用FITC-anti rat CD32和FITC-anti ratκ+λ轻链抗体,流式细胞术(flow cytometry, FCM)分析表明杂交瘤细胞表面表达BCR和FcγRⅡB;将融合蛋白同杂交瘤细胞共孵育之后,利用Biotin-anti humanγchain的抗体结合FITC-Avidin显示融合蛋白对杂交瘤细胞具有较强的结合能力。将融合蛋白以不同浓度(100μg/ml, 50μg/ml, 10μg/ml以及0μg/ml)分别与培养的杂交瘤细胞TIB175共孵育,以人IgG作为对照,48小时后活细胞计数结果显示融合蛋白作用组活细胞所占比例呈剂量依赖方式下降;AnnexinV/PI染色,FCM分析结果显示融合蛋白可显著促进杂交瘤细胞的凋亡;Tunel染色、激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)观察进一步证实了细胞的凋亡;在孵育结束前16h加入BrdU,孵育结束后用BrdU试剂盒进行检测,FCM分析结果显示融合蛋白治疗组BrdU阳性细胞数明显低于其他治疗组;细胞周期结果也显示融合蛋白可使细胞发生G1期阻滞,从而抑制细胞的增生。此外,融合蛋白与杂交瘤细胞共孵育后加入人外周血单核细胞作为效应细胞、补体作为效应分子,FCM分析表明融合蛋白可通过其Fc段介导效应细胞和补体特异性诱导杂交瘤细胞的凋亡。三、分析AChR-Fc融合蛋白对EAMG动物模型AChR反应性B细胞的作用用重组表达的ECD蛋白混合完全弗氏佐剂免疫Lewis大鼠构建EAMG动物模型。分离大鼠脾细胞,体外同融合蛋白孵育后,FCM分析结果显示融合蛋白和脾细胞有较高的亲和力;ELISPOT检测发现融合蛋白作用组AChR反应性B细胞数目呈剂量依赖式下降,将融合蛋白和脾细胞作用48h后,FCM结果显示融合蛋白在体外可诱导CD19+B细胞的凋亡。将融合蛋白以及人IgG尾静脉注射EAMG大鼠,对照组给予PBS,每周3次,共4周进行治疗。每周留取血清标本,ELISA检测发现融合蛋白治疗组血清中抗体滴度明显下降。进一步用ELISPOT分析发现融合蛋白治疗组脾脏中AChR反应性B细胞数清除率明显增高。本研究成功表达了AChR-Fc融合蛋白,并通过体内外实验初步分析了融合蛋白对AChR反应性B细胞的作用,为进一步研究融合蛋白对MG的治疗作用奠定了基础。本研究首次提出靶向清除自身反应性B细胞的新策略,有望建立特异性治疗自身免疫病的新平台。