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目的：缓和内质网应激相关的非折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)对于真核生物细胞的存活是至关重要的。作为UPR一个主要的下游通路,X盒结合蛋白1(X-box binding protein1, XBP1)可以触发一系列级联反应来缓解内质网应激,而它的表达是受一种非常规的剪接机制所调控的,即在特异性核酸内切酶IRE-1和一种未知的RNA连接酶共同作用下移除XBPlu mRNA分子内一个26nt (nucleotide)的内含子。与已知的发生于细胞核中的常规剪接不同,对于这种非常规剪接的亚细胞定位仍存在很大争议。而且已知XBP1s与人类肿瘤的发生密切相关,如肝癌、多发性骨髓瘤及乳腺癌等,那么肿瘤细胞中XBP1mRNA的剪接及XBP1s转录因子的生成是否存在独立于内质网应激的其他通路也是未知。本课题拟以乳腺癌细胞系为模型,研究乳腺癌细胞中的XBP1mRNA剪接的亚细胞定位,同时明确乳腺癌细胞中是否存在独立于内质网应激的XBP1mRNA的非常规剪接机制及这一非常规剪接与乳腺癌细胞发生发展的关系。以期为乳腺癌的治疗提供新的靶点。方法：1.通过RT-PCR技术检测乳腺癌细胞中XBP1mRNA的表达水平及其剪接情况。2.构建内质网应激荧光蛋白指示器模型ERAI (ER stress activated indicator, ERAI),转导入MCF-7细胞筛选出理想的细胞模型MCF-7/ERAIm454-557用于研究乳腺癌细胞中XBP1mRNA的非常规剪接。3.通过DTT诱导试验及洗涤试验评估ERAIm454-557mRNA及XBP1mRNA对内质网应激的敏感性差异。4.通过RT-PCR评价IRE1α降表达对XBP1mRNA及ERAIm454-557mRNA非常规剪接的影响。通过免疫荧光试验检测在内质网应激条件下乳腺癌细胞中IRE1α的定位。5.通过核质分离RT-PCR比较细胞质及细胞核中XBP1mRNA及ERAIm454-557mRNA的剪接差异,明确mRNA剪接的亚细胞定位。6.利用放线菌素D (Act D)抑制MCF-7/ERAIm454-557模型细胞的转录后,再行核质分离RT-PCR评价Act D对XBP1mRNA及ERAIm454-557mRNA的剪接影响；另外以20mM DTT诱导MCF-7细胞并随时间梯度收集总RNA行RT-PCR检测XBP1mRNA的剪接情况。从而分析内质网应激与非内质网应激依赖性XBP1mRNA剪接的相关性。7.构建XBPlu与mCHerry荧光蛋白融合的片段缺失亚型,转导入MCF-7细胞,观察细胞荧光强度及荧光定位,并通过RT-PCR观察不同亚型之间XBP1mRNA的剪接差异。8.构建仅含有XBP1mRNA中茎环结构的ERAIm485-530模型,并转导入MCF-7细胞中观察细胞荧光强度,评价应激敏感序列对XBP1mRNA(?)常规剪接的影响。9.DTT诱导MCF-7细胞后提取细胞质总RNA,平均分为四份分别静置Omin、10min、20min、40min,然后通过RT-PCR检测XBPlu mRNA及XBP1s mRNA的水平,评估两者稳定性差异。10.将XBP1过表达及降表达质粒分别转导入MCF-7/ERAI454-557模型细胞， RT-PCR实验检测XBP1及ERAI mRNA表达量的变化及其剪接差异。11.采用细胞计数法及Soft Aga实验分别检测XBP1s降表达及过表达对乳腺癌细胞增殖能力、克隆形成能力的影响。结果：1.在无内质网应激的条件下,乳腺癌细胞中存在XBP1s mRNA,且水平高于正常乳腺上皮细胞。2.筛选出了理想的内质网应激指示器模型ERAIm454-557,并经测序证实ERAIm454-557mRNA的剪接与XBP1mRNA的剪接方式相统一。3.DTT诱导试验及洗涤试验证实ERAIm454-557mRNA对内质网应激的敏感性远远低于内源性的XBP1mRNA。4. RT-PCR结果显示IRE1α降表达质粒可以明显的抑制ERAIm454-557mRNA的剪接；IRE1α免疫荧光结果发现DTT诱导组非常明显的出现IREla的细胞核定位,这表明在内质网应激条件下,IRE1α可以易位到细胞核。5.核质分离RT-PCR结果显示：在没有内质网应激的前提下,且细胞核中剪接后的ERAIm454-557mRNA的相对水平与细胞质中的无明显差异。在内质网应激的条件下,细胞质中剪接后的ERAIm454-557mRNA及XBP1mRNA均明显增加,而细胞核中并无明显增加。6. Act D抑制试验结果表明在正常条件下,ActD并不能诱导明显XBP1mRNA的剪接,但是它可以增加细胞核中剪接后的ERAIm454-557mRNA的比率。但是在0.5mM DTT诱导条件下,ActD可以明显增加XBP1s mRNA及剪接后的ERAIm454-557mRNAl的比率。在高浓度DTT诱导的内质网应激前提下,随着诱导时间的延长,细胞质中剪接后的：KBP1mRNA明显增加,而细胞核中剪接后的XBP1mRNA则只是在逐步缓慢的增加。这一结果表明内质网应激也可以促进细胞核中XBP1mRNA的非常规剪接。7.5’端缺失的XBP1mRNA亚型可以明显的增加非内质网应激依赖性的XBP1mRNA的剪接,由此推论XBP1mRNA的结构变化可能会影响非常规剪接的定位。8. MCF-7/ERAIm485-530细胞可检测到微弱的细胞荧光,RT-PCR结果也显示在无内质网应激条件下ERAIm485-530mRNA存在少许的剪接,且DTT诱导对ERAIm485-530mRNA的剪接并无影响；MCF-7/ERAIm485-530细胞核质分离RT-PCR结果则显示ERAIm485-530mRNA的非常规剪接发生于细胞核中。9.细胞质总RNA按时间梯度静置后行RT-PCR结果显示,随时间延长XBP1s mRNA出现明显降解,而XBPlu mRNA降解不明显,说明XBP1u mRNA的稳定性优于XBP1s mRNA。10.无内质网应激条件下,XBP1降表达并不能明显的降低XBP1mRNA的水平；而在DTT诱导下,XBP1降表达不仅明显降低了XBP1s mRNA的水平,还增加了XBPlu mRNA的水平。同时,在无内质网应激条件下,XBP1降表达明显降低了剪接后的ERAIm454-557的水平；而在DTT诱导下,XBP1降表达也可以明显抑制ERAIm454-557剪接。11.细胞计数及Soft Aga试验结果发现XBPls过表达后MCF-7细胞增殖能力及克隆形成能力均增强。结论：1.乳腺癌细胞中存在非内质网应激依赖性的XBP1mRNA的剪接,且XBP1mRNA茎环结构两端的应激敏感序列是XBP1mRNA非常规剪接的关键。2.非内质网应激依赖的XBP1mRNA的剪接发生于细胞核中并需要IRE1α的参与。3.MCF-7细胞中XBPls的存在可能是由于细胞核中的非内质网应激依赖的非常规剪接。4. XBPls可以促进MCF-7细胞的生长。