赭曲霉毒素A对PCV2的复制促进及硒的阻断作用与机制研究

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猪圆环病毒2型(PCV2)是猪圆环病毒病(PCVD)的主要病原,但并不是所有复制PCV2的猪都会发生PCVD。PCVD主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征和猪呼吸道综合征等,其中最严重的是断奶仔猪多系统衰竭综合征。该病广泛存在于全世界,但其发病率和致死率在不同地区、不同的猪场差异很大。有研究表明PCVD的发生与动物饲养管理、病原共感染、环境应激和营养等因素有关。但目前其致病机制仍不是很清楚。赭曲霉毒素A(OTA)是曲霉菌和青霉菌产生的真菌毒素,广泛存在于食品和饲料中,且在饲料和血液中的污染水平在不同的农场和国家之间差异很大。OTA对动物和人具有很强的肾毒性,但其毒性的机制还不是完全清楚。有研究表明,OTA的毒性与其干扰抗氧化酶合成的作用和产生活性氧(ROS)有关。硒是机体必需的微量元素之一,具有许多生物学功能,包括提高机体抗氧化能力和免疫力、拮抗有毒元素、减少应激反应和抗病毒感染等。目前认为,硒发挥其生物学功能主要是通过硒蛋白的形式。有研究表明,与无机硒相比,有机硒具有毒性小、生物利用率高的特点。目前,有关OTA与PCV2的关系还未见报道,且硒与OTA之间的关系仍不是很明确。本论文从体内到体外研究了 OTA的毒性及其对PCV2感染的影响与信号通路机制以及硒的保护作用与机制,部分解释了 PCVD在不同地区、不同猪场发病率和致死率有很大差异的原因,为PCVD的防控和硒特别是有机硒在养猪生产上的应用提供了科学依据。试验一、赭曲霉毒素A对PCV2复制的作用研究为研究赭曲霉毒素A(OTA)对猪圆环病毒2型(PCV2)体内外复制的影响,我们应用了 PK15细胞和PCV2阳性感染的猪作为模型。PCV2感染的PK15细胞24h后,用0、0.01、0.05、0.1和0.5 μg/ml的OTA作用48h后测定PCV2 DNA拷贝数和阳性感染细胞数。选取了 27头感染PCV2的42日龄杜洛克断奶仔猪,随机分为3组,Con组(饲喂基础日粮),OTA组1(基础日粮+75μg/kgOTA),OTA组2(基础日粮+150μg/kgOTA)。试验持续42天。在试验开始前和结束后称体重,在试验的第0天,14天,28天和42天度仔猪进行前腔静脉采血,并在42天采血结束后将仔猪处死,取肝、肺、脾、肾、支气管淋巴结和腹股沟淋巴结,血样和组织用于测定PCV2 DNA拷贝数。体外试验结果表明,0.01-0.05 μg/ml的OTA可显著增加PCV2 DNA拷贝数和阳性感染细胞数,且0.05 μg/ml的OTA有最大的作用。体内试验结果显示,饲喂基础日粮的猪肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、腹股沟浅淋巴结和支气管淋巴结几乎未检测到OTA;饲喂添加75μg/kg和150 μg/kg OTA的日粮后可各自提高血清OTA浓度(0.27-0.47 μg/ml 和 0.40-0.69 μg/ml)、组织 OTA 浓度(0.05 to 0.11 μg/g 和 0.08 to 0.16μg/g)。在第0天,各组试验猪的PCV2DNA拷贝数无差异。与对照组相比,在第14和28天,饲喂75μg/kgOTA的仔猪PCV2DNA拷贝数有所增加,但差异不显著;在第42天,PCV2DNA拷贝数显著增加,但是,饲喂150μg/kgOTA的猪PCV2DNA拷贝数没有显著变化。此外,与对照组相比,饲喂75 μg/kgOTA的猪肾脏、脾脏和肺脏中PCV2DNA拷贝数显著增加,饲喂75μg/kg和150 μg/kgOTA的猪支气管淋巴结中PCV2 DNA拷贝数显著增加。试验结果表明低剂量的OTA可促进PCV2的体内外复制,部分解释了在不同猪场PCVD发病率和严重程度的差异。试验二、赭曲霉毒素A对PCV2复制作用的机制研究前一章试验结果表明低剂量的OTA可促进PCV2的复制。为了研究OTA对PCV2复制作用的机制,我们应用了 PK15细胞作为模型,测定了氧化应激指标、p38和ERK1/2的表达及其磷酸化水平;并应用NAC和p38/ERK1/2的抑制剂和特异性siRNA研究其对OTA促进PCV2复制的影响。试验结果显示,低剂量的OTA可显著降低PK15细胞中还原型谷胱甘肽,NF-E2-related因子2和γ-glutamyl-cysteine合成酶mRNA的表达,增加ROS水平,氧化剂水平,和丙二醛含量,诱导p38和ERK1/2的磷酸化。添加NAC可逆转OTA引起的上述指标的变化。应用p38和ERK1/2各自的干扰RNA减少其表达或抑制剂(SB203580和U0126)抑制其磷酸化后,OTA对PCV2复制的促进作用减弱。这些结果表明,低剂量的OTA可引起氧化应激,激活p38/ERKl/2MAPK信号通路,从而促进PCV2的复制。试验三、硒阻断OTA促进PCV2复制的作用与机制研究本试验研究了硒阻断OTA对PCV2复制的促进作用与机制。我们应用了高表达硒蛋白S和低表达硒蛋白S的PK15细胞为模型,测定了 PCV2 DNA拷贝数和阳性感染细胞数,ROS和GSH水平和p38磷酸化水平。试验结果显示,0.05μg/ml的OTA可显著增加PCV2 DNA拷贝数和阳性感染细胞数,硒可阻断OTA对PCV2复制的促进作用。高表达SelS可降低PK15细胞中PCV2 DNA拷贝数和阳性感染细胞数,低表达SelS可增加PK15细胞中PCV2DNA拷贝数和阳性感染细胞数,但差异不显著。高表达SelS可显著阻断OTA对PCV2复制的促进作用,低表达SelS可显著增强OTA对PCV2复制的促进作用。0.05μg/ml的OTA可使ROS水平上升,GSH含量降低,p38磷酸化水平升高。高表达SelS可减弱可降低ROS水平,提高GSH水平,抑制p38磷酸化,低表达SelS有相反的作用。试验结果表明,硒阻断OTA对PCV2复制的促进作用,且硒蛋白S在该过程中起着很重要的作用。试验四、硒对OTA引起的肾毒性的作用与机制研究本试验研究了硒代蛋氨酸对赭曲霉毒素A引起的猪肾15肾毒性的的保护作用。我们测定了细胞活力、LDH活性、caspase 3活性、Annexin V,ROS和GSH水平及硒蛋白的表达。试验结果显示,赭曲霉毒素A可引起肾毒性,呈剂量依赖关系。0.5、1、2和4μM的Se对赭曲霉毒素A引起的肾毒性有显著的保护作用。硒代蛋氨酸可提高谷胱甘肽过氧化物酶l(GPxl)的活性,mRNA和蛋白的表达,GPx4和硫氧还蛋白还原酶1的mRNA的表达,其中硒对GPxl表达的促进作用最大。对GPxl进行RNA干扰后,硒代蛋氨酸对赭曲霉毒素A引起的肾毒性的保护作用减弱,从而说明硒减轻赭曲霉毒素A引起的肾毒性的过程中,GPxl起着至关重要的作用。我们的研究表明,硒代蛋氨酸可能是一个有吸引力的抗氧化剂,可减少人类和动物受OTA引起的肾脏损害的风险。
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