哺乳动物性别控制和繁殖效率的提升依赖于性腺分化和生殖细胞发生机制的研究,同时这也是畜牧研究的热点和发育生物学研究的重要问题之一,但其确切的机制并不完全清楚。性腺分化和性别决定是一个受多种因素调控的复杂过程,主要取决于性染色体(X、Y),其中Y染色体占主导作用,Y染色体上Sry基因的表达与否决定了性腺向睾丸或卵巢的分化。而精子和卵子的产生是由性染色体主导下的性腺微环境所决定。本研究以B6.XYTIR小鼠为基础,建立了 XY性反转雌性小鼠的繁育和鉴定方法,结合XO雌性小鼠,初步分析了其生殖能力丧失的可能原因,并筛选了性腺分化和生殖细胞发生过程中差异表达的基因,为进一步研究哺乳动物的性别决定机制提供了强有力的工具。1.XY性反转雌性小鼠和XO雌性小鼠的繁育和鉴定本实验室从加拿大引进了一种能产生性反转后代的B6.XYTIR小鼠。这种B6.XYTIR雄性小鼠与野生型B6雌性小鼠自然交配,其后代中会出现部分XY性反转雌性。通过肛殖距的观察和性腺解剖结构来确定其性别表型;同时提取组织DNA后,扩增Y染色体上Zfy基因的部分片段,来确定其基因型,以此来鉴定XY性反转雌性小鼠。考虑到XY性反转雌性小鼠中X和Y染色体有可能存在不配对的情况,同时利用XO雌性小鼠来进行研究。B6.XPafY雄性小鼠与野生型B6雌性小鼠自然交配,提取后代仔鼠DNA扩增Zfy基因,提取RNA检测Xist基因的表达,鉴定基因型,结合表型鉴定,得到XO雌性小鼠。Xist基因是一个重要的长链非编码基因,当两条X染色体同时存在时(基因型为XX)才表达,因此通过Xist基因的表达与否及Zfy基因的存在与否可决定其基因型为XX、XY或XO。结果表明,B6.XYTIR仔鼠经表型鉴定后,部分雌鼠DNA中可以扩增到一条大小为618 bp的目的基因条带,表明该小鼠为XY性反转雌性小鼠,同时B6.XPafY后代中部分雌鼠中没有扩增到Zfy基因和Xist基因,表明获得XO小鼠。本研究旨在繁育并鉴定XY和XO雌性小鼠,为小鼠发育过程中性别决定相关研究提供动物模型。2.XY性反转雌性小鼠的初步分析本研究通过形态学观察、免疫荧光和石蜡切片等方法对XY性反转雌性小鼠的性腺进行了初步分析,研究了性腺分化过程中睾丸支持细胞和生殖细胞的分布。利用全组织免疫荧光方法,用生殖细胞特异性蛋白Tra98和睾丸支持细胞特异性蛋白Sox9对性腺进行免疫荧光染色。结果表明,野生型XY雄性胚胎中生殖细胞完全由睾丸支持细胞包裹并成管状排列,XX雌性胚胎中无睾丸支持细胞且生殖细胞均匀分布于性腺。而XYTIR雄性性腺中,睾丸支持细胞在13.5 dpc时不能完整包裹生殖细胞,性腺分化不完全,而在15.5 dpc和17.5 dpc时才逐步建立正常的细胞分布模式,这可能提示其性腺发育较野生型晚。野生型XX雌性生殖细胞数量在性腺发育过程中不断减少,只有少部分生殖细胞保存到出生,这个过程称为卵母细胞消退。对XY雌性小鼠的初步分析发现,其拥有一套完整的生殖系统,卵巢中可产生卵泡,通过超排可得到卵母细胞,但随着日龄增长,卵泡和卵母细胞数量会急剧下降至消失,而在性腺发育过程中,其卵母细胞消退程度比野生型更剧烈,说明XY雌性小鼠还可作为卵母细胞消退研究中的动物模型。3.性腺分化中差异表达基因的筛选和功能预测以XO卵巢、野生型XX卵巢、野生型XY睾丸为对照,对XYTIR卵巢和XYTIR卵睾复合体进行转录组分析,旨在筛选性腺分化过程的差异表达基因,并进行功能预测。通过维恩图和层级聚类分析筛选到的差异基因经GO分析发现,差异基因主要富集在细胞通讯负调控、性腺发育、性别分化和第一性征的发展等生物过程。KEGG Pathway分析发现,差异基因主要富集在卵巢类固醇生成、Wnt信号通路、皮质醇合成与分泌、类固醇激素生物合成、库欣综合征、醛固酮合成与分泌等代谢途径。综上所述,本研究通过繁育得到了 XY雌性小鼠和XO雌性小鼠,并建立了简单、高效的鉴定方法,对其生殖系统的分析也有助于对这一特殊动物模型的深入了解,为深入研究性腺分化、生殖细胞发生和卵母细胞消退(卵巢早衰)提供了独特的视角。同时通过转录组分析筛选到了一系列与性腺分化和生殖细胞产生相关的基因,可为进一步的研究提供方向。